流感病毒血凝素蛋白裂解机制的研究进展

血凝素(Hemagglutinin,HA)是流感病毒的主要表面抗原之一,诱导机体产生中和抗体,介导病毒囊膜与靶细胞膜融合,从而启动病毒对宿主细胞的感染过程。HA蛋白以前体形式合成,需经宿主蛋白酶水解为HA1、HA2两个亚单位,并以二硫键连接,病毒才获得感染性。研究表明宿主蛋白酶的分布与流感病毒感染后的致病力和组织嗜性有直接关系。潜在的裂解酶及其抑制因子的发现为流感的防治提供了新的思路,成为干预治疗的新潜在靶点。就当前国内外关于流感病毒血凝素的结构与功能、裂解机制及其应用的研究进展进行综述。     

一株针对H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白茎部的单克隆抗体的表征

流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)的茎部区相对保守,是广谱疫苗、抗体与病毒检测制剂的重要靶点.前期研究获得了一株与H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白茎部多肽(aa 428-452)反应的单克隆抗体(5D3-1B5).为系统评价其生物学特性,本研究测定了5D3-1B5的抗体效价(IgG、血凝抑制与病毒中和...     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性

通过反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增了H5N1亚型鹅源禽流感病毒 (AIV)完整的血凝素 (HA)基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果已经登陆GenBank ,登陆号为AY6 394 0 5。序列分析表明所扩增的HA基因开放性阅读框架 (ORF)由170 7个核苷酸组成 ,共编码 5 6 8个氨基酸 ,裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF ,含连续的碱性氨基酸 ,具有高致病性AIVHA基因裂解位点的特征。构建了含HA基因的真核表达载体pcDNA HA ,通过与鼠白血病病毒 (MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT6 0和pHIT111共转染人胚肾细胞 2 93T ,4 8h后收集假病毒上清 ,超离后通过Western blot证明HA蛋白能够在假病毒颗粒表面表达 ,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染 2 93T、COS 7和NIH3T3三种不同的靶细胞 ,证实所构建的假病毒粒子具有感染性和泛嗜性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV HA假病毒体系 ,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1／2002（H9N2）分子鉴定与起源分析

运用RT—PCR技术扩增了禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1／2002（H9N2）完整的血凝素（HA）基因,并克隆到pGEM^R-T载体中,进一步进行了序列测定。序列测定结果已经登陆GenBank,登陆号为AY364228。所扩增的HA基因长度为1683核苷酸,共编码560个氨基酸,其中信号肽长度为18aa,HA1为319aa,HA2为223aa。HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为RSSR↓GLF,不舍连续的碱性氨基酸,具有低致病性AIVHA基因裂解位点的序列特征。通过构建一个包含18株H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化树,发现所有的18个毒株共可分为欧亚谱系和北美谱系两个谱系,而本分离株在分类地位上国内另外的三个分离株同属于欧亚谱系,在遗传进化上非常接近,表明它们可能具有共同的起源。     

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型。将其中一株Sw／SD／1／2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2亚型的HA基因进行比较,发现Sw／SD／1／2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck／GX／99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck／YN／2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw／SD／1／2003(H9N2)起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw／SD／1／2003的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不问,Sw／SD／1／2003的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G,而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G。     

基于血凝素关键序列的流感病毒疫苗

流感病毒的血凝素(HA)位于流感病毒包膜上,在流感病毒吸附和穿入宿主细胞的过程中起着重要作用.血凝素以三聚体的形式镶嵌在病毒包膜上,每个单体糖蛋白是由两个经二硫键连接的蛋白亚单位组成,即HA1和HA2.血凝素属Ⅰ型膜蛋白,其一级结构含有4个结构域:信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域. 血凝素是流感病毒最主要的表面抗原,它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和病毒.血凝素一般含有5 个抗原决定簇,流感病毒的流行与其抗原结构的变化密切相关.主要就血凝素的结构和功能、流感病毒疫苗以及以血凝素基因关键序列为基础的流感病毒疫苗进行阐述.     

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型.将其中一株Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2 亚型的HA基因进行比较,发现Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck/GX/99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck/YN/2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw/SD/1/2003 (H9N2) 起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不同,Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G, 而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G.     

表达H5亚型AIV血凝素的重组NDV构建及免疫原性

利用反向遗传技术获得表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。克隆NDV clone 30的全长基因,通过在NDV的融合蛋白基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间插入编码高致病性AIV分离株A/chicken/italy/8/98(H5N2)的血凝素基因开放阅读框从而获得两株重组新城疫病毒NDVH5和NDVH5m。NDVH5感染的细胞可以检测到两种HA转录产物。对于重组病毒NDVH5m,NDV位于HA ORF的转录终止信号序列被沉默突变消除,产生2.7个全长HA转录产物的折叠,从而使修饰过的HA得到稳定地高表达。1日龄小鸡的脑内接种证实了两种重组病毒均无致病性。鸡群在NDVH5m诱导产生的NDV和H5亚型AIV HA特异性抗体的免疫力下能够免于致死剂量的NDV与高致病性AIV的感染。血清学研究结果表明NDVH5m免疫鸡群产生的抗体可结合NP蛋白抗体的检测从而用于区分免疫和感染AIV的动物。因此,NDVH5m重组病毒可作为抗NDV和AIV的"二联疫苗",也可成为控制AJ的标记疫苗。     

禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科流感病毒属的成员。AIV核酸为单链线状分段RNA,病毒表面囊膜上镶嵌着两种重要纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA与病毒的毒力、传染性密切相关。其中ha基因是最重要的免疫原性基因,它刺激机体所产生的抗体可中和病毒、抵抗感染,     

呼吸道蛋白酶TMPRSS2和HAT裂解流感病毒血凝素的亚细胞定位及对蛋白酶抑制剂的不同敏感性

流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA）被宿主细胞蛋白酶裂解是病毒感染和扩散的关键。已有研究表明,人呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）和跨膜丝氨酸蛋白酶S1成员2（TMPRSS2）是人类呼吸道裂解HA的蛋白酶。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白裂解与致病性的研究

冠状病毒的致病机理一直不清楚。对副粘病毒和正粘病毒的研究结果表明病毒的致病力与病毒纤突蛋白裂解程度有关,反过来纤突蛋白裂解程度是由纤突蛋白的连结多肽的氨基酸顺序决定的。本文试图从IBV致细胞病变作用,纤突蛋白裂解状态和连结多肽氨基酸顺序三个方面探讨IBV的致病机理。结果表明,IBV毒株在不同细胞培养(CK.CEF和Vero)中,从宿主细胞范围、致细胞病变作用和引起细胞融合几项指标表现了不同的致病力,但不同毒株从同一种细胞释放后其纤突蛋白的裂解程度无差异。连结多肽的氮基酸序列表明23株IBV的连结多肽均由5个氨基酸组成即二对碱性氨基酸Arg—Arg和Arg—Arg,中间由苯丙氨酸或丝氨酸联接。这些结果说明在致病机理方面,冠状病毒可能不同于副粘病毒和正粘病毒。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。     

H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别

建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究。参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp。经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应。敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带。结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型。另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力。     

流感病毒利用其神经氨酸酶蛋白逃避NK细胞激活受体的识别

<正>自然杀伤(NK)细胞在抗病毒感染和消灭转化细胞的过程中发挥核心作用。通过抑制和激活受体控制病原体感染细胞和肿瘤细胞的识别。曾表明NK细胞激活(杀伤)受体中的天然细胞毒性受体NKp44和NKP46,可与流感病毒感染的细胞表面表达的病毒血凝素(HA)蛋白相互作用。我们进一步发现,NKp44/NKP46和病毒的HA之间的相互作用     

H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别

建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究.参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp.经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应.敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带.结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型.另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力.     

HA基因322位和329位氨基酸对H5N1亚型禽流感病毒毒力的影响

A/mallard/Huadong/S/2005(S,IVPI=2.65)和A/mallard/Huadong/Y/2003(Y,IVPI=O),是对麻鸭具有不同致病力的病毒.两病毒的HA裂解位点区有2个氨基酸差异,S病毒在HA裂解位点区322是Leu(L322),329位缺失(-329),而Y病毒322位是Gin(Q 322),329位是Lys(K329).根据这两个位点的差异,利用反向遗传系统,以S和Y病毒各自为骨架,拯救HA基因突变病毒,检测获救的突变病毒对麻鸭的毒力.可以得知,以S病毒为骨架,将S病毒HA基因322位Leu替换为Gln和(或)在329位添加Lys,以及用Y病毒的HA(Q322L,K329-)替换S病毒HA,获救的重组病毒对麻鸭亦完全无致病力;但以Y病毒为骨架,将Y病毒HA基因322位Gln替换为Leu和(或)在329位缺失Lys后,Y重组病毒对麻鸭的毒力上升.结果提示,S和Y病毒HA基因裂解位点区322和329氨基酸残基突变或缺失均影响病毒对麻鸭的致病力,且HA基因与其它基因的匹配性显著影响病毒对麻鸭的致病力.     

四株单纯疱疹病毒(HSV)感染 四种细胞的SDS—PAGE分析

我们用 SDS—PAGE 测定四株 HSV 感染 HEp—2细胞、HeLa 细胞、人胚肺细胞、鸡胚细胞多肽与未感染细胞多肽的电泳图结果表明:四小时感染细胞多肽与未感染细胞多肽相比未见有区别,二十四小时的感染细胞多肽与未感染细胞多肽的电泳带显示有所区别。其中感染 HSV—1和 HSV—2型的鸡胚细胞多肽电泳带亦显示有所区别。说明鸡胚细胞对 HSV—1型和 HSV—2型的敏感性差异,亦可以从电泳带反映出来,说明电泳带可作为 HSV 分型的又一方法。经蔗糖梯度超离心纯化的未标记同位素的地方株 HSV—1CC21株和 HSV—2W 株病毒颗粒用 SDS 裂解,并进行 SDS—PAGE 表明这两株病毒的结构多肽分别为12和15种,显示型的区别。本文还就关于在制备疫苗时以选择何种细胞为宜的问题进行了讨论。     

一种以我国痘苗病毒天坛株血凝素基因为选择标记的新型系列表达载体的构建

本文作者从痘苗病毒天坛株Sal I基因文库中确定并分离了痘苗病毒血凝素(HA)基因并组建了以HA为选择标记的系列表达载体,可用于不同结构和不同要求的外源基因在真核细胞中的表达。本系列载体的优点是,在病毒重组过程中可避开传代细胞系,一次性选择出可供疫苗使用的重组病毒。而HA阴性的重组病毒的毒力在家兔皮内试验中,未见明显下降。