新型分序仪将大分子片段沉积在薄膜上

TE2000型直接印迹分序仪能在14×16cm凝胶上分离大分子片段。片段从凝胶底部移到凝胶正下方由皮带传动尼龙膜上。调节好皮带的传动速度,使落下来的胶带均匀分布在尼龙膜上,而不象标准分序凝胶上常出现的高分子量片段集结在顶部的情形。处理这个薄膜比处理大而脆的分序凝胶更简单、更省时。用比色法即可检测薄膜上的序列,而不需     

生物技术简讯

新产品最新信息 Amersham国际信息公司又出版一份EXTRAS,这是20页的简讯,详细介绍它的新产品。这一期收编了广泛的技术,包括杂交、DNA测序、Western blotting、ECL技术、放射自显影和光检测,以及荧光技术。还详细介绍了放射安全性方面的产品、一种热稳定DNA聚合酶以及三种专为分子生物学家设计的新书。特异性细胞结合 TechGen International现在提供AIS Micro CELLector细胞培养瓶,这种培养瓶的表面能结合特异的单克隆抗体,因此可以特异地对细胞表现型进行正筛选或者直接剔除。采用专有的附着技术,即可将特异性细胞受体结合到培养瓶的表面。添加血液或骨髓样品之后,固定化受体即与目标细胞的表面抗原     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响.采用抗凋亡抑制蛋白-Survivin的抗体,对细胞裂解液进行蛋白质印迹.与常规操作方法不同之处是：在电转移的凝胶“三明治”中,重叠放置两张硝酸纤维素膜.电转移后,对两张膜同时进行免疫印迹.在特定的转移条件下,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象.转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量,都是影响蛋白质透膜的相关因素.电转移中蛋白质的透膜,可以产生“印迹复制失真”的效应,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果.所得实验结果和结论,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题,对于科学掌握和应用该技术具有积极作用.     

Northern印迹检测小RNA

<正>Northern印迹是一种常用的RNA定性和定量分析方法。与mRNA等大分子RNA类似,microRNA等小分子RNA也可以通过电泳级分、转膜、杂交等Northern印迹操作进行定性、定量的分析。下面与大家分享我们实验室小RNA Northern印迹的一些经验。     

中国汉族群体(西安)DNA HaeⅢ系统遗传多态性

建立了Ｄ２Ｓ９２、Ｄ２Ｓ４４、Ｄ１０Ｓ２８、Ｄ１７Ｓ７９ ４个位点的荧光检测ＲＦＬＰ技术,准确、快速、安全。同时,对尼龙膜ＤＮＡ固定、剥脱尼龙膜再杂交进行了实验,结果表明,碱性磷酸酶标记寡核苷酸探针和荧光检测技术具有很高灵敏度和稳定性,检测样本ＤＮＡ的最小量约３－２５ｎｇ。它将在法医鉴定、基因诊断和遗传研究等领域中发挥越来越大的作用。采用严格地随机抽样,对西安汉族群体进行遗传学调查,用ＡＬＩ８７４     

植物病毒检测技术──组织印迹法

组织印迹法（Tissue blotting）是在酶联免疫吸附（Enzyme-Linked immunosorbent Assay ELISA）的基础上发展起来的植物病毒检测技术,该技术不仅保持了ＥＬＩＳＡ对病毒检测的灵敏度高,特异性强的特点,而且大大地简化了操作程序,对病毒的检测更加快速、简单、方便、印迹在硝酸纤维素膜上的样品能保存３个月以上,检测结果能直观地显示出病毒感染的部位。组织印迹技术尤其适用于植物病毒的大规模普查。     

应用亲和免疫印迹技术检测血清微量单克隆Ig

介绍了一种简便、快速、灵敏的检测血清微量 mIg 的新方法——亲和印迹法.首先将特异性 Ab 结合到 NC 膜上,以薄层琼脂糖凝胶区带电泳把蛋白分离,蛋白经毛细印迹到 NC-Ab 膜上与其抗体亲和,再用酶标抗体探测被印迹之蛋白.2h 内可显示出 mIg 的特征.不需任何昂贵特殊设备.其敏感度大约是自然印迹法的10倍,是 IF银染色法的100倍.     

用反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌

目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。     

绿色化学产业——微生物发酵生产长链二元酸

所谓长链二元酸是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸,它们是一类用途广泛和重要的精细化工产品,是化工上合成高级麝香香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电解质,高级尼龙粉末涂料和油漆、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、聚酐、医药和农药等的重要原材料。     

半干式蛋白质电泳印迹的影响因素及条件优化

采用蛋白质分子量标准物和纯化的重组蛋白质进行半干式蛋白质印迹,探讨半干式电泳印迹的多种因素对印迹效果的影响。结果表明:在不同电转移条件下,均存在不同程度的蛋白质透膜转移现象,当电流强度恒定时,电转移时间过长和上样量过大是造成实验中透膜转移而丢失的主要原因,可根据待测蛋白质的分子量和表达丰度确定恰当的电转移时间和上样量。     

双印迹：解决第二抗体非特异性结合问题

在免疫印迹技术中印迹蛋白与非相关第二抗体之间的相互作用会产生假阳性。已经开发了某些程序以期减少这种吸附。Gershoni在1988年就已强调解决这一问题的困难。通过使用一种新膜(DB膜),并从印迹蛋白中提取原始抗体,使这种程序消除了干扰蛋白,并使第二抗体的非特异性结合成为不可能,因此认为上述非特异性结合问题能够解决。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ的分子印迹电化学生物传感器

应用分子印迹技术,以邻苯二胺和对苯二酚为功能单体,心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)为模板分子,在pH 7.0磷酸盐缓冲液中,利用循环伏安法在玻碳电极表面聚合形成了分子印迹膜.该分子膜对cTnI有特异性识别作用,在0.01～2.00 μg/mL的范围内,cTnI的浓度与氧化峰电流的变化呈线性关系,检测下限为2 ng/mL,响应时间为15 min.该分子印迹传感器具有制备简单、特异性及稳定性好等优点.     

单克隆抗体免疫印迹法:人免疫球蛋白活性是随着多肽链分离而丧失

<正>本文报道了单克隆抗体对人免疫球蛋白链在免疫印迹膜上免疫活性的丧失,讨论了抗原决定簇被破坏的原因,并提出了适宜于这种单克隆抗体使用的另一种PAGE系统。     

新型青霉素生物传感器的研究

以青霉素为模板分子,采用溶胶-凝胶法合成分子印迹膜,以浸泡的方法移除印迹分子,制备青霉素分子印迹膜电极。本印迹电极能有效地避免类似物对其测定的干扰。通过循环伏安法研究传感器对青霉素的响应特性,结果表明:富集时间为200 s,在0.1~1.8μg/L质量浓度范围内,青霉素在磷酸缓冲液(PBS)中的电流强度与其浓度呈良好的线性关系。吸附后的膜电极用甲醇洗脱后再生,可以重复利用3次,可以应用到实际检测中。     

蛋白免疫印迹法检测小分子蛋白的实验条件优化研究

目的:蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析。为了提高蛋白免疫印迹法的检测效率,需针对不同蛋白的特性调节相关的实验条件参数。本文旨在探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响,从而优化并获得最佳实验条件。方法:比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。结果:选择20 V、10 min转膜电压和时间所获得的信号显著高于10 V、25 min转膜条件,选择含20%甲醇转移缓冲液所获得的信号显著高于无甲醇转移缓冲液,选择飞克级化学发光剂所获得的信号显著高于纳克级化学发光剂。结论:选用高电压、短时间组合,选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测。     

从植物共生菌宏基因组文库筛选新的生物催化酶基因

【目的】通过建立宏基因组文库的高通量保存与基于探针洗脱的多次膜杂交筛选方法,从植物共生菌宏基因组文库筛选具有生物催化潜力的新酶基因。【方法】首先根据滴度将初始文库噬菌体包装颗粒感染到EPI300-T1R E.coli,过夜培养后对应保存于96孔板;提取粘粒进行文库的杂交筛选。【结果】描述的洗脱条件可完全去除尼龙膜上与靶DNA结合的探针,并且尼龙膜上的靶DNA至少可用于7次探针杂交,从而明显提高宏基因组文库的筛选效率。【结论】以Enoate reductase(ER)和短链脱氢酶(SDR)的同源基因片段为探针,运用该方法经两轮筛选获得候选单克隆并进行了部分粘粒的测序,发现了新的ER和SDR同源基因,并克隆到相应的全长基因序列用于后续的表达与酶化学研究。     

生物技术简讯

用放射标记探针进行核酸印迹的快速杂交目前,Amersham Life Science 公司提供了一种新型缓冲液,使~(32)P 标记的核酸探针快速杂交到膜结合靶上。这种新的改良缓冲液称为 Rapid-hyb 缓冲液,具有广泛的应用,包括进行 Southern 印迹、     

长链二元酸工业化前景及展望

1 汽车工业是特种尼龙树脂的最大应用领域。1998年以前国内的消费量约为3000吨/年,使用的主要品种是尼龙11和尼龙12。进口价格为14万元/吨（人民币）,共4.2亿元; 2 我国每年进口服装用高档尼龙热溶胶1500吨,8万元/吨,共1.2亿元; 3 我国每年进口汽车、纺织、航空工业用的高级尼龙粉末涂料约1000吨,12万     

同源异型盒基因Emx在人胎盘绒毛膜中的扩增

以鹌鹑Emx cDNA片段作为探针,对人胎盘绒毛膜细胞和成人血细胞的基因组DNA进行DNA印迹分析. 结果表明,在人胎盘绒毛膜细胞中Emx基因剂量较成人血细胞高6倍,显示Emx基因在人胎盘绒毛膜细胞基因组中发生了扩增.