茜草内生菌的分离鉴定及其抗菌活性物质研究

对中药植物茜草(Rubia cordifoliaL)的内生菌进行了分离和抗菌活性筛选,获得一株具有广谱抗菌活性的内生细菌。该细菌对常见的3种人类病原菌和4种植物病原菌具有拮抗作用。传统分类学和基于16S rRNA基因的分子分类学证据表明,该内生细菌为一株新的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilisRC4。B.subtilisRC4在综合马铃薯培养基(pH值5.0)中于28℃振荡培养60h,产生的代谢物对白色念珠菌的抗菌活性最强。抗菌活性物质在100℃受热20min,活性维持80%以上,且在pH值2.0~11.0范围内稳定。经硅胶柱层析和高效液相色谱分离,得到主要抗菌活性化合物,质谱分析表明其分子量约为288Da。     

植物内生菌生物抗菌活性物质研究进展

植物内生菌作为一种新型的微生物资源,分离和确定其代谢产物是一条寻找新型天然活性物质的重要途径。目前为止,许多研究者从不同的植物内生菌中分离到大量具有抗菌活性的新化合物,这些新的化合物被认为是解决日益严重的微生物多重耐药性的希望之一。本文从植物内生菌的多样性、抗菌活性物质多样性及国内内生菌研究进展等多个角度概述了当前有关植物内生菌研究的主要成果和最新进展,以期为植物内生菌相关研究提供借鉴。     

骆驼刺内生菌分离及代谢物活性成分分析

采用研磨法首次从新疆药用植物骆驼刺茎和叶等组织中分离得到20株内生菌并从中筛选出一株对作物致病菌的拮抗活性最强的内生菌XJAS-AB-11。通过形态学观察,生理生化特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株XJAS-AB-11初步鉴定为枯草芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。进一步对该拮抗菌株进行扩大培养,对其代谢产物进行初步研究,经硅胶柱色谱及TLC从具有抑菌作用的活性部位分离出活性单体C2和H2-2。紫外光谱、核磁共振氢谱及质谱分析证明化合物C2和H2-2均属于黄酮类化合物。研究表明,骆驼刺植物内生菌中蕴藏着较丰富的抗菌活性物质,是开发天然抗菌药物的潜在资源。     

基于植物内生菌及其次生代谢活性物质多样性的研究

据相关研究表明,植物内生菌属于新型微生物资源,并且种类较多,分布广泛,譬如在最近几年,科学家逐渐发现在植物内生菌中发现了紫杉醇等生物活性物质以及在一些产物中还发现了与次级代谢产物中相同的产物,因此对临床研究具有重要价值和潜在价值。对此研究的主题为:基于植物内生菌及其次生代谢活性物质多样性的研究。本为将从植物内生菌的多样性,植物内生菌次生代谢活性物质的多样性等方面进行逐一研究,现将文章综述如下。     

怀地黄活性内生菌的分离鉴定及抗菌抗肿瘤活性

利用平板分离法从怀地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)中分离出内生菌共130株,包括67株细菌、50株真菌和13株放线菌。利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉作为供试菌株,通过对峙试验和平板点接法筛选出8株对3种供试菌株均具有较强拮抗作用的内生菌。经菌种形态观察、生理生化实验以及16S rRNA序列测定,这8株活性内生菌均为假单胞菌属的细菌,并分别与Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas thivervalensis、Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas koreensis和一个未定种具有最高相似性。对这8株活性内生菌进行液体发酵、不同有机溶剂抽提和抗菌抗肿瘤研究,结果表明它们的乙醇抽提物和乙酸乙酯抽提物均不同程度地对3种供试菌株和食管癌细胞系Ec9706具有抑制作用。其中2-2号菌株(Pseudomonas chlororaphis)抗菌抗肿瘤作用最强,具有重要的开发价值。     

药用植物内生菌的分离及抗菌活性的初步研究

为研究药用植物金荞麦、款冬及黄皮树中内生菌的抗菌活性,筛选具有广谱抗菌效果的内生菌。以导致人畜及植物致病的15种病原微生物为拮抗菌株,采用改进K-B纸片法、生长速率法及琼脂二倍稀释法进行抑菌试验。结果从三种药用植物中共分离到内生菌38株,其中FE-R9、TE-R7、PE-S11三株内生真菌发酵液提取物对10种人畜指示菌的最低抑菌浓度(M IC)分别在7.50~15.00 g.L-1、3.13~12.50 g.L-1、0.39~15.00 g.L-1之间。FE-R9、TE-R7、PE-S11对多种病原微生物具有显著抑制生长的作用,这可为寻找天然抗菌物质提供资源。     

云雾龙胆内生菌的分离鉴定及抗菌活性分析

从云雾龙胆(Gentiana nubigena)中分离到一株具有抗菌活性的内生细菌LD5,该菌株的发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长有显著的抑制作用。通过形态学、生理生化和16SrDNA系统进化分析,鉴定LD5为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株LD5能合成黄酮类化合物、龙胆苦苷,以及一种与云雾龙胆醇提取物相似的代谢产物。     

植物内生菌活性代谢产物最新研究进展

内生菌广泛存在于植物组织中,作为一种新型的微生物资源,具有丰富的物种多样性,也是发掘新型天然活性物质的重要途径之一,有些内生菌还能产生与宿主植物相同或相似的活性成分。因此从植物内生菌中挖掘抗菌尤其抗临床耐药菌、抗肿瘤等天然活性产物不仅为新药的研发提供了新的方向,还能在一定程度上解决传统的天然产物药源——药用植物生长缓慢、资源紧缺等问题。从多个角度概述了近年来国内外报道的植物内生菌次生代谢产物及其来源、生物活性等方面的主要成果和最新进展,以期为植物内生菌活性代谢产物的研究提供参考。     

一株抗MRSA内生细菌的鉴定及其活性物质

根据生理生化特征和16S rDNA序列,对一株从新疆苦豆子Sophora alopecuroides中分离的、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)具有较强拮抗作用的内生细菌菌株KDNB6进行鉴定;并通过硅胶柱、凝胶柱层析从该菌发酵产物中分离纯化了抗MRSA的活性物质。结果表明菌株KDNB6各项特征与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens最为接近,鉴定为S.marcescens。从菌株KDNB6的代谢产物中分离到一个抗MRSA的活性成分。     

大花黄牡丹内生菌的分离鉴定及其抗菌活性菌株的筛选

采用研磨法从健康大花黄牡丹的根、茎、叶柄、叶和种子中进行菌种分离,依据其形态、培养特征及其他生物学特性对菌株进行初步鉴定;采用平板对峙法对分离的内生菌进行拮抗试验研究,并对强活性菌株进行16S rD-NA序列鉴定,以明确大花黄牡丹内生菌的种类,筛选对农作物病害有抑制作用的菌株.结果表明:(1)获得内生真菌188株,鉴定为10个属,以短蠕孢属(50％)、青霉孢属(18.6％)和曲霉孢属(12.3％)为优势种群.获得内生放线菌145株,以链霉菌属(98.6％)为优势种群.表明大花黄牡丹内生菌在数量和种类上存在极丰富的多样性,同时在不同组织存在一定的差异性.(2)抑菌试验结果显示,21.6％真菌对指示菌有抑菌作用,抑菌圈直径最大为10mm;27.8％放线菌对指示菌有抑菌作用,其中菌株PND31的抑菌活性较强,抑菌谱较广.(3)16S rDNA序列鉴定显示,菌株PND31与链霉菌属聚在一起,初步归为链霉菌属一个种.     

酸枣根系空间分布特征对自然干旱梯度生境的适应

以烟台、石家庄、银川和吐鲁番四个地区自然干旱梯度条件下生长的酸枣植株为试验材料,对酸枣根系的次生木质部导管及不同径级根系的分布特征进行研究。结果表明:从烟台到吐鲁番,酸枣根次生木质部中导管数量逐渐增多,管径依次增大。酸枣细根(d≤2 mm)长度远远大于其它径级根系的长度。随着干旱程度的增加,垂直方向上,细根出现在较深的土层,水平方向上,酸枣根幅扩大到560 cm,在末端或者接近末端的地方出现较多的细根分支。随着干旱程度的增加,5 mmd10 mm的根系长度在总根长中所占的比例逐渐增大,其可能为干旱生境中植株根系获取水分和养分的主要部位。不同生境中酸枣根系空间分布特征的变化是其长期生存于梯度干旱环境的适应特征。     

野生酸枣光合及叶绿素荧光参数对土壤干旱胁迫的响应

为探究鲁中地区自然条件下野生酸枣光合生理参数对土壤逐渐干旱的响应机制,明确其与土壤水分的定量关系。该研究以2年生野生酸枣盆栽苗为实验材料,采用人工给水和自然耗水相结合法模拟自然条件下土壤干旱过程,分析野生酸枣叶片光合作用和荧光参数对土壤水分含量(RWC)的响应过程及其机制。结果表明:(1)野生酸枣叶片气体交换参数净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、水分利用效率(WUE)均随着土壤含水量的增加表现出先升高后降低的趋势。当RWC38.5%时,P_n下降,而胞间二氧化碳浓度(Ci)上升,气孔限制值(L_s)下降,叶片光合速率下降主要是非气孔限制因素所致;当RWC在38.5%~65.1%范围内,野生酸枣P_n下降,伴随C_i、气孔导度(G_s)均降低,野生酸枣叶片光合速率下降处于气孔限制阶段。(2)通过P_n和WUE对土壤水分的阈值模拟,发现维持野生酸枣叶片具有较高光合生产力的土壤水分范围为46.0%~0.5%,维持其较高水分利用效率的水分范围为56.3%~73.9%。(3)在土壤逐渐干旱过程中(RWC范围为29.9%~86.5%),野生酸枣最大荧光(F_m)、PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)逐渐降低,初始荧光(Fo)显著升高,光化学猝灭(qP)先升高再降低,非光化学猝灭(NPQ)在过高(RWC83.7%)或过低(RWC38.5%)的土壤水分下呈现较高值,表现出热耗散增加。研究认为,野生酸枣叶片气体交换参数及叶绿素荧光参数对土壤水分均具有明显的阈值响应,阈值点的土壤相对含水量大约为38.5%,低于阈值时叶片光合速率由气孔限制转向非气孔限制,PSⅡ受到损伤,电子传递受阻,光合机构受到破坏。     

酸枣果提取物在体内外对抗生素的增效作用及机制研究

作者研究团队先前从酸枣果的氯仿提取物中精制得到其低极性范围的活性组合物Fr.2a,发现Fr.2a与多种抗生素联用显示出广泛的协同抗菌作用。该研究在Fr.2a的基础上利用硅胶柱层析对酸枣果氯仿提取物中其他极性范围内的活性成分进行了分离纯化,得到精制物Fr.B,并对精制物Fr.B进行GC MS、核磁共振氢谱、红外光谱分析,以确定Fr.B的组成成分;通过抗菌谱分析和细胞通透性分析,以明确Fr.B的抗菌增效谱和抗菌增效机制;采用熔和法将精制物Fr.B制备成软膏,通过小鼠伤口感染模型评价该软膏对抗生素的增效效果。结果表明：(1)由酸枣果氯仿提取物进一步精制得到的Fr.B组分,主要包含反油酸、油酸、顺 10 十六碳烯醇、棕榈酸等脂肪酸类化合物。(2)Fr.B分别与庆大霉素、妥布霉素、氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、夫西地酸、制霉菌素、酮康唑和两性霉素B等多种抗生素联用时显示出广泛的协同抗菌作用。(3)Fr.B可破坏细胞膜和细胞壁的完整性而增强细菌细胞的通透性。(4)在体内和体外Fr.B均能显著增强红霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀菌作用,从而提高红霉素对MRSA菌株引起的伤口感染的治疗效果。研究表明,本研究所得到的Fr.B具有广谱的抗菌增效活性,能够增强红霉素对伤口耐药菌感染的治疗效果。该研究结果为克服微生物对抗生素的耐药性提供了新的思路和解决方案。     

自然干旱梯度下的酸枣表型变异

表型变异是植物应对环境变化的一种策略。酸枣植物从中国东部沿海到内陆腹地均有分布,其表型性状的变异可能解释其对自然干旱梯度的适应机制。为验证这一假说,以烟台、石家庄、银川、吐鲁番4个自然干旱梯度生境中生长的酸枣三年生植株的12个表型性状为调查研究对象,采用变异系数和巢式方差分析对酸枣的表型变异进行分析。结果表明:(1)从烟台到银川,叶面积、叶长、叶周长和叶柄长总体呈减小的趋势,而比叶面积呈增大的趋势;(2)随着干旱程度的增强,二次枝的长度、二次枝的基部粗、二次枝的枣吊数、茎比密度和茎水分含量均呈减小趋势,并且种子重和种子短轴长也均呈减小的趋势;(3)对沿干旱梯度分布的4个酸枣种群而言,叶性状的平均变异系数(33.70%)枝性状的平均变异系数(32.41%)种子性状的平均变异系数(9.07%),并且酸枣性状间存在很强的协变。结果表明酸枣的地上部分形态性状沿干旱梯度表现出很强的变异,推测在未来的气候变化下,酸枣将通过这种表型变异的有效组合来适应环境变化。     

酸枣叶片结构可塑性对自然梯度干旱生境的适应特征

叶片是植物体暴露于环境中面积最大的器官,其最易感知环境变化而发生形态和结构上的改变。为探究植株叶片结构对不同生境的适应机理,研究以生长在烟台-石家庄-宁夏-新疆不同地域气候条件形成的自然梯度干旱环境中的酸枣为试验材料,应用植物显微技术研究酸枣叶片的结构的可塑性对不同自然梯度干旱环境的适应特征。结果表明:酸枣叶表皮着生有表皮毛,表皮细胞外覆有角质层与蜡质。叶肉为全栅型,栅栏组织发达,海绵组织退化,叶肉中有晶体及大量的分泌细胞。从烟台至新疆随生境梯度干旱加剧,酸枣叶片叶面积逐渐变小,叶片厚度依次增加,叶表皮角质层加厚,且上角质层厚度大于下角质层厚度;叶片上下表皮细胞长径及短径先增后降,栅栏组织总厚度和密度依次增大、层数减少,各层栅栏组织细胞的长径逐渐增加。叶脉薄壁细胞相对厚度逐渐减小,导管管径增大,晶体(草酸钙晶体)数增多。在梯度干旱环境中酸枣植株通过减小叶面积、提高栅栏组织密度、增加叶片及角质层厚度降低蒸腾作用,减少水分散失;通过增大导管管径提高水分利用率;通过增加晶体数量提高叶片机械性能,改变细胞的渗透势、提高吸水和保水能力。上述叶片结构的变化是酸枣植株长期对不同自然梯度干旱生境的适应特征。由此可知,叶片形态结构中叶面积、叶片厚度、角质层及叶肉组织(栅栏组织)随环境变化的可塑性较大。     

酸枣根系结构可塑性对自然梯度干旱生境的适应机制

根系是植物吸收水分和养分的主要器官,是直接接触土壤最先感受土壤逆境胁迫的部位。在干旱环境中,植物根系的结构特征必定发生改变以维持正常的生物机能而生存。目前,关于根系解剖结构的研究大多集中于根系的某一特定结构对单一逆境因子的响应。以生长在烟台-石家庄-银川-吐鲁番不同地域气候条件形成的自然梯度干旱环境中的酸枣为试验材料,应用植物显微技术研究酸根系结构的可塑性对不同自然梯度干旱环境的适应机制,结果表明:酸枣根的初生结构包括表皮、皮层和维管柱,表皮位于幼根的最外层,由单层体积较小、紧密排列的表皮细胞组成。皮层占根初生结构的大部分比例,由体积较大的多层薄壁细胞组成,薄壁细胞近似圆球形,数目众多,呈环形分布。维管柱位于最内层,细胞小而密集,由中柱鞘、初生木质部、初生韧皮部及薄壁细胞组成。随生境干旱加剧,酸枣根初生结构表皮细胞的厚度和宽度逐渐增加,皮层薄壁细胞的厚度和宽度、皮层薄壁细胞层数和皮层厚度均以宁夏银川样地的最大。酸枣根的次生结构包括周皮(木栓层、木栓形成层、栓内层)和次生维管组织(次生韧皮部、维管形成层和次生木质部)。从烟台至新疆吐鲁番随生境干旱加剧,酸枣植株根系周皮逐渐加厚、致密度提高。次生木质部中,导管的数量增加,管径增大。干旱环境中,酸枣植株根系结构上的变化一方面提高了吸水能力和输水效率,另一方面增强了保水能力,减少水分散失,这可能是其适应干旱逆境的机制之一。     

灵武长枣果实维管束韧皮部及周围细胞的超微结构特征

为了探讨灵武长枣果实光合同化物韧皮部卸载和运输的途径,该研究采用透射电镜技术,对不同发育时期灵武长枣果实维管束韧皮部及其周围薄壁细胞的超微结构特征进行了分析.结果表明:筛管/伴胞复合体及其周围韧皮薄壁细胞间在果实膨大前期富含胞间连丝,而韧皮薄壁细胞与周围库细胞以及相邻库细胞间几乎不存在胞间连丝,形成共质体隔离;筛管/伴...     

灵武长枣果实发育结构特征研究

采用石蜡切片法,研究不同发育时期灵武长枣果实的结构特征。结果表明:(1)缓慢生长期细胞增长缓慢,外果皮细胞5~6层,表皮细胞由1层薄壁细胞构成,呈长矩形或长椭圆形,表皮细胞以内的薄壁细胞不断增生,形成内表皮细胞。果实体积增大伴随着空腔的出现,中果皮维管束数量多;(2)第一次快速生长期细胞增长迅速,表皮细胞排列疏松,中果皮中的空腔增大速度最快,维管束主要分布在靠近外果皮和内果皮的中果皮部位;(3)减缓生长期表皮细胞变成圆形或椭圆形等不规则形状,细胞排列松散,内表皮细胞形状、大小不一,细胞排列疏松。中果皮中的空腔继续增大,维管束数目逐渐减少,但变化幅度较小;(4)第二次快速生长期外果皮细胞层数减少到3~4层,表皮细胞和内表皮细胞难以区分,空腔随着果实体积的增大达到最大,许多细胞单列排成网状结构,形成更大的腔,果皮中的维管束分布最少。在灵武长枣果实发育过程中,不同发育时期的不同部位其果实的形态解剖特征不同。     

水稻内生菠萝泛菌YJ76吲哚产量上调突变株的鉴定及生理性状

菠萝泛菌(Pantoea ananatis)YJ76是从水稻"越富"品种中分离的优势内生菌,与宿主水稻互作时具有多种促生作用,其分泌的吲哚作为细菌种内及种间的信号分子参与调控多种生理生化行为。[目的]筛选获得与吲哚调控相关的突变株,鉴定突变位点并研究突变基因对菌株的生存适应性以及对宿主水稻定殖和促生的影响,为研究吲哚调控通路奠定基础。[方法]用双亲本接合法构建YJ76的mTn5转座子插人突变文库,以染色体步移TAIL-PCR技术鉴定突变基因,最后探究基因突变对菌体产生的影响。[结果]筛选到1株吲哚产量大幅上升的YJ76突变株M04,鉴定突变位点为一个长度195 bp未报道过的新基因,将其命名为ipc(indole production control),基因突变后增强了YJ76对重金属、四环素和酸的抗性,也增强了菌体对宿主水稻定殖和促生的能力。[结论]吲哚产量上调的ipc突变株能够提高菌体生存适应性并增强其对宿主水稻定殖和促生的能力。     

光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究

为探索贵州苗药光枝勾儿茶内生真菌类群特征、分布部位及其抑菌活性,该研究采用传统方法对贵州省贵阳市和黔西市光枝勾儿茶内生真菌进行分离,并基于分子生物学及统计学对其分类地位进行鉴定及多样性评价,最后通过微量肉汤倍比稀释法筛选具有抑菌活性的菌株。结果表明:(1)从光枝勾儿茶中分离到191 株内生真菌,隶属于3 个门5 个纲10 个目15 个科19 个属,优势属为叶点霉属(Phyllosticta)、间座壳属(Diaporthe)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)和刺盘孢属(Colletotrichum)。(2)黔西光枝勾儿茶内生真菌香农-维纳多样性指数(H''_Q=2.112)较贵阳(H''_G=1.801)高,索伦森相似性指数Cs_G-Q为0.923,不同组织香农-维纳多样性指数为茎(H''_S=2.004)>根(H''_R=1.764)>叶(H''_L=1.654)>果实(H''_F=1.473),茎和叶内生真菌的索伦森相似性最高(Cs_S-L=0.667)。(3)筛选出的21株内生真菌对供试菌大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和沙门氏菌(Salmonella enterica)具有抑菌效果,其中Diaporthe sp. QX4G6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为12.5、6.25、12.5 mg·mL^-1,最小杀菌浓度分别为12.5、6.25、12.5 mg·mL^-1。以上研究结果揭示了光枝勾儿茶蕴藏丰富的内生真菌资源,不同地区及组织内生真菌类群组成有差异,多个分离菌株具有抗菌活性,为光枝勾儿茶内生真菌天然抗菌药物或药源研发奠定了基础。