寻找克隆基因的探针

基因表达和DNA复制应用到基因克隆的具体方法和技术及其概念在不断发展变化。首先DNA是应用纯化了的限制性内切酶在核酸序列上的特异部位切割下来的DNA片段,许多DNA片段用DNA连接酶把它们拼接成克隆工具。限制性内切酶和DNA连接酶在进行筛选时已加以纯化了,这两种酶在商业上是有价值的。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

分子克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的分子克隆中,主要通过限制性内切酶先分别消化目的 DNA片段及载体,再纯化回收,然后用DNA连接酶将二者连接。而对一些超短基因片段(300 bp),通过酶切及切胶纯化后,回收率极低,导致插入表达载体比较困难。文中介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法,大大提高了克隆效率,为短基因片段的分子克隆提供了一种高效的方法。     

单纯疱疹病毒2型特异性DNA片段的克隆和鉴定

用核酸限制性内切酶BamHI对单纯疱疹病毒2型(HSV—2)的DNA进行酶解,回收位于基因组中的反向重复序列区的Bam HIG片段,然后将其克隆在载体质粒PUC 8的Bam HI切点上,进一步用核酸限制性内切酶Eco RI和KPNI对这一重组质粒联合酶解,移去EcoRI—KPNI小片段,经末端修饰后,将其连接得到新的重组质粒pRC102,它含有一小段HSV—2的DNA序列。以此质粒为探针,分别与HSV—1、HSV—2及细胞DNA进行斑点杂交;与HSV—1和HSV—2酶解后的DNA片段进行Southern转印系交。两组实验结果显示,pRC102质粒DNA只与HSV—2 DNA特异性杂交,其HSV—2的型特异性良好。     

一种简单有效的克隆未知旁侧DNA片段的方法

操作含长插入片段的DNA克隆时 ,经常需要进行亚克隆和测序实验。通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱 ,然后选择合适的内切酶消化DNA ,分离靶片段 ,将其连接入质粒载体中进行下一步操作。但这种方法工作量大 ,步骤繁琐。在此 ,介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析 ,而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法。首先 ,选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆 ,其中一种酶切在已知的旁侧序列上 ,另一为随机选择 ;然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接 ,转化细菌得到一“亚克隆库” ;将其中的克隆挑选入 96孔板培养后 ,按行或列混合菌液得到相应的“pool” ;最后 ,用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆 ,其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对 ,另一个与质粒载体上序列配对 ,PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆。多次独立实验表明该方法简单有效 ,可广泛用于亚克隆和DNA步移实验     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用

传统的DNA重组方法Type Ⅱ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction, TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板--Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

Construction of Rice DNA Finger Print by SRFA

ＲＡＰＤ用于生物鉴定具有快速、简便、经济等优点。但是,由于该法所用引物通常为９～１０个寡聚核苷酸,与ＰＣＲ使用特异引物相比,其Ｔｍ值相对较低,扩增反应易受外界条件影响,重复性较差。ＳＲＦＡ技术采用设计有限制内切酶位点的人工合成接头与引物互补,弥补了ＲＡＰＤ法的上述不足。Ｆｉｇ．１为ＳＲＦＡ的技术路线。为提高连接效率,在同一试管内,用ＰｓｔＩ酶解基因组ＤＮＡ,并与人工接头连结,制备ＳＲＦＡ扩增的模板。合成与接头序列相应的引物。对南方５个野生稻品种和籼、粳稻各一个栽培品种进行ＳＲＦＡ扩增。Ｆｉｇ．２表示：每种材料均能获得约１０条以上的扩增条带。条带的大小在４００２０００ｂｐ之间。栽培稻品种中出现多态性片段：用引物１可得一条（１．３ｋｂ）片段,用引物２可得２条（１．１ｋｂ、０．７ｋｂ）片段。与ＦＡＰＤ法相比,ＳＲＦＡ法增加２０％的多态性。栽培稻与野生稻之间在多态性上没有差异,说明两者亲缘关系非常接近。五种野生稻的图谱可分为两类：江西、湖南、广西的与籼稻相近,广东、云南的与粳稻相近。当然,这还有待其它方面的研究来验证。接头的设计要求避免自身连结,与目的片段连结后不能再被ＰｓｔＩ切开。引物包括不变序列和选择序列两部     

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb¹. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits². During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel''s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight³. The leading model for DNA movement through an agarose gel is "biased reptation", whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along⁴. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation⁵; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 8. Determine the sizes of separated DNA fragments       

SRFA法构建水稻DNA指纹图谱

水稻基因组DNA用PstⅠ酶切同时与人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测所构建的水稻DNA指纹图谱。结果表明在JX17和ZYQ8间以及5种野生稻间均存在DNA多态性片段。     

Separation and recovery of DNA fragments by electrophoresis through a thermoreversible hydrogel composed of poly(ethylene oxide) and poly(propylene oxide)

We have synthesized and characterized a thermoreversible hydrogel of multiplied block copolymers, composed of poly(ethylene oxide) and poly(propylene oxide), for DNA electrophoresis. The aqueous solution of block copolymers turned into a hydrogel upon heating at temperatures above 10-11 degrees C, whereas it reverted into a solution upon cooling. Linear double-stranded DNA molecules migrated through the gel matrices at a rate that was inversely proportional to the logarithm of the DNA length. The hydrogel is most effective for separating DNA fragments in the 10- to 2000-bp range. The resolving range lay in-between the effective ranges of polyacrylamide and agarose gel electrophoreses of DNA. The gel slices containing DNA fragments were liquefied by cooling on ice, and the DNA was precipitated with ethanol. No contaminants that inhibit enzymatic reactions were found in the DNA recovered from the hydrogel. Plasmid DNA recovered from the hydrogel was recircularized with T4 DNA ligase and yielded highly efficient Escherichia coli transformation. Therefore, thermoreversible gel electrophoresis will be a useful method for DNA separation and isolation in recombinant DNA technology.     

琼脂糖凝胶的合适浓度对于回收酶切后质粒载体的重要性

目的：探讨琼脂糖凝胶的不同浓度对回收不同大小的酶切后质粒载体纯度的影响。方法：将2种质粒载体酶切,并经不同浓度的琼脂糖凝胶电泳分析,通过比较酶切前和酶切后载体的相对位置,研究胶浓度对回收酶切后载体纯度的影响。结果：不同浓度的琼脂糖凝胶中,酶切前和酶切后载体的相对位置会发生变化,对能否成功回收到纯度高的酶切后DNA片段有重要影响;质粒大小不同,胶浓度的影响也不同。结论：合适的胶浓度对于回收酶切后质粒载体具有重要意义,应选择合适的胶浓度回收酶切后质粒载体。     

应用Agilent 2100 Bioanalyzer分析限制性显示技术制备的HIV片段库

使用Agilent 2 10 0Bioanalyzer分析限制性显示技术 (restrictiondisplay ,RD)制备的HIV片段库 .利用合适的限制酶从质粒上获得HIVB亚型代表株U2 6 94 2全基因cDNA ,然后将目的片段进行Sau3AⅠ消化 ,在消化得到的片段两端加接头 ,利用通用引物进行PCR扩增 ,扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳以及Agilent 2 10 0Bioanalyzer两种方法分析 .结果显示 ,Agilent 2 10 0Bioanalyzer比琼脂糖凝胶电泳能更快速、直接和客观地反映RD技术制备的DNA片段的大小以及含量 ,并能对RD PCR过程中片段自身连接以及优势扩增的现象进行直接的监控作用 .     

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRI部分消化的水稻(Oryza sativa L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJs97。pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2 000多个克隆。转化子DNA的southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。     

放线菌的单酶切AFLP基因分型研究

使用MseI限制性内切酶对放线菌链霉菌属中的12株菌基因组DNA进行酶切,与接头连接后,引物使用一个选择性碱基对模板进行PCR扩增,PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果表明,对于MseI内切酶产生的模板,选择性碱基采用A、T、C和G都能够获得清晰丰富的条带。MseI内切酶产生的图谱上有72个位点,多态性位点71个,达98．6％。因此,使用MseI内切酶适合构建放线菌的单酶切AFLP指纹图谱。     

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。     

Measurement of radiation-induced DNA double-strand breaks by pulsed-field gel electrophoresis

We have examined the use of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) to measure DNA double-strand breaks induced in CHO cells by ionizing radiation. The PFGE assay provides a simple method for the measurement of DNA double-strand breaks for doses as low as 3-4 Gy ionizing radiation, and appears applicable for the measurement of damage produced by any agent producing double-strand breaks. The conditions of transverse alternating field electrophoresis determined both the sensitivity of the assay and the ability to resolve DNA fragments with different sizes. For example, with 0.8% agarose and a 1-min pulse time at 250 V for 18 h of electrophoresis, 0.39% of the DNA per gray migrated into the gel, and only molecules less than 1500 kb could be resolved. With 0.56% agarose and a 60-min pulse time at 40 V for 6 days of electrophoresis, 0.55-0.90% of the DNA per gray migrated into the gel, and molecules between 1500 and 7000 kb could be resolved.