PC-1分子在细胞内定位的深入探讨

为了寻找影响PC-1分子进入细胞核的序列,将该分子不同区段分别与EGFP融合表达,通过观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布,发现PC-1分子的第112～190区段是一独立的功能区,缺失这一区段后,分子的其余部分能够进入细胞核并在其中积累,这一区段使PC-1分子被排斥于细胞核之外,并在细胞质中浓缩成许多点状结构.运用以SOS恢复系统为基础的酵母双杂交方法,发现PC-1分子能够定位于细胞膜上,通过缺失突变发现该分子的第112～190区段是一独立的细胞膜定位信号序列,这一序列将其定位于细胞的胞膜上.     

PC-1基因在前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2不同细胞周期的表达

目的:检测PC-1基因在前列腺癌细胞周期中各时间点的表达变化。方法:用200 ng/mL诺可唑(nocoda-zole)处理前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2,16 h后使细胞处于G2/M期,在不同时间点收获细胞,分别进行流式分析和Western印迹,检测PC-1基因的表达。结果:流式分析和Western印迹结果显示,在G2/M期,LNCaP和C4-2前列腺癌细胞系中PC-1基因高表达。结论:PC-1基因的表达与前列腺癌细胞的细胞周期有关,提示PC-1可能在细胞周期调控中发挥作用。     

人CUIAA重组腺病毒载体的构建及其在PC-12细胞中的表达特点

目的构建并鉴定带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）报告基因的人源CUL4A（hCUIAA）基因腺病毒表达载体Ad—hCUIAA—GFP,探求bCUIAA在PC-12细胞中的表达特点。方法扩增hCUIAA基因,并通过In—FusionPCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315-EGFP—hCUIAA,利用AdMaxTM腺病毒包装系统将该穿梭质粒与腺病毒表达载体骨架质粒pBHGloxAEl,E3Cre共转染HEK293细胞,经GFP荧光检测和Western印迹检测确认hCUIAA的表达后,进一步通过病毒扩增及纯化得到hCUL4A重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP。将该载体转染Pc—12细胞,观察hCUIAA—GFP融合蛋白在Pc-12细胞中的表达情况。结果成功获得了较高滴度的腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP（1．6×10^12pfu／m1）。荧光检测表明,Ad—hCUIAA—GFP转染Pc-12细胞后72h内,病毒转染率随着时间和病毒转染滴度的增加而增加。DAPI细胞核荧光染色结果表明,hCUIAA—GFP的表达主要集中在细胞质部分。GFP荧光检测及Western印迹检测结果显示,hCUIAA—GFP在Pc-12细胞中的表达量随时间和病毒转染滴度的增加而增加。结论带GFP的hCUIAA重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP构建成功,掌握了其转染Pc-12细胞的最佳滴度及其在Pc-12细胞中的时空表达特点,为今后对hCUIAA在PC-12细胞中的功能性研究奠定了基础。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

PLK3在前列腺癌细胞中的表达与定位

据报道,Polo样蛋白激酶3(polo-like kinase 3,PLK3)具有促进前列腺癌细胞的生长增殖及迁移能力。本研究旨在构建pCDNA3-FLAG-PLK3真核表达质粒,初步探究其在前列腺癌细胞系内的表达与定位,并检测前列腺癌细胞系中的内源PLK3蛋白水平。根据PLK3蛋白的编码序列设计合成PLK3蛋白编码序列的引物,以含有PLK3蛋白编码序列的质粒作为模板,并通过PCR扩增目的片段,再用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切、连接并转化后,挑取单克隆菌落扩增并提取质粒,进行双酶切鉴定以及测序比对。将序列比对正确的重组质粒转染至CWR22Rv1及LNCaP细胞中,利用Western Blot实验检测重组质粒在CWR22Rv1和LNCaP细胞中的表达;以免疫荧光染色实验检测外源的FLAG-PLK3蛋白在细胞中的定位。此外,利用Western Blot实验检测了在五种前列腺癌细胞系中内源PLK3蛋白水平。本研究经过以上实验构建出了FLAG-PLK3真核表达质粒,并且验证其能够在前列腺癌细胞中表达;通过免疫荧光确定FLAG-PLK3蛋白在细胞中主要分布在细胞膜中,少量分布在细胞...     

香蕉Maasr1基因表达产物的亚细胞定位

利用SSH分离香蕉果实采后差异表达基因,获得香蕉的ASR基因,并将其命名为Maasr1。对该基因与香蕉采后成熟衰老进行相关性研究,发现其在果实采后早期表达上调。通过对Maasr1基因进行生物信息学分析表明,Maasr1基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核或细胞质中。为进一步深入研究该基因功能,构建了香蕉Maasr1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA1304-Maasr1。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,Maasr1基因表达产物定位在细胞核中,符合转录因子特性。     

香蕉MuMADS1基因表达产物的亚细胞定位

MuMADS1是从香蕉果实cDNA文库中筛选分离到的一个MADS—box基因．通过生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核中,而且芯片分析表明：该基因在果实成熟早期表达上调．是乙烯的上游调控因子,可能与花的发育、果实发育及成熟相关．为进一步深入研究该基因功能。构建了以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein．GFP）为报告基因的融合植物表达载体pCAMBIA1304 MuMADS1．利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达．荧光显微镜检测结果表明。该基因表达产物定位于细胞核中．符合转录因子特性．     

p53负调控前列腺癌细胞中PC-1基因的表达

在前列腺癌进展中发生的PC-1基因表达失调和p53基因突变,提示这两个事件之间可能存在的联系.用依托泊苷处理前列腺癌LNCaP细胞后,PC-1蛋白的表达受抑制;瞬时转染分析表明野生型p53负调控PC-1启动子的转录活性;缺失突变分析将PC-1基因启动子上受p53负调控的区域定位在翻译起始位点上游757 bp～323 bp之间.缺失PC-1启动子上的雄激素受体反应元件并没有消除p53对其转录活性的抑制作用;无论p53是否存在,组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理LNCaP细胞后可以导致PC-1启动子转录活性升高.因此,p53和去乙酰化酶可以独立抑制PC-1启动子活性.这些研究结果表明,野生型p53负调控PC-1基因启动子的转录活性,而前列腺癌进展过程中p53突变可能和PC-1基因的表达失调有关.     

PC-1在前列腺癌细胞中促进c-myc基因的表达

前列腺癌相关基因PC-1(Prostate and colon gene1)是属于癌基因D52家族成员,具有促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的功能。为了研究PC-1发挥这种生物功能的分子机制,文章在PC-1高表达的LNCaP-pc-1及对照LNCaP-zero细胞中,利用RT-PCR和Western blotting等方法检测c-myc基因表达;提取两细胞胞质和胞核蛋白,利用Western blotting分析c-myc上游调节蛋白β-catenin变化;利用c-Myc蛋白抑制剂10058-F4作用前列腺癌细胞C4-2,Western blotting检测PC-1蛋白表达变化。发现PC-1促进c-myc基因表达,并促进β-catenin入核;c-Myc蛋白抑制剂10058-F4可抑制PC-1的表达。结果表明:PC-1在前列腺癌中促进c-myc基因的表达,并且这种促进作用可能是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。同时,PC-1与c-Myc蛋白间可相互促进,进一步促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长。     

向光色素Phototropin1的细胞和亚细胞定位

向光色素 1 (ｐｈｏｔ1 )是在蓝光 (ＢＬ)下进行自我磷酸化的Ｓｅｒ/Ｔｈｒ型光受体激酶 ,它的两个保守的ｄｏｍａｉｎ分别结合着作为发色团的两个ＦＭＮ分子。它是与原生质膜 (ＰＭ)结合的 1 2 0ｋＤ的蛋白。ｐｈｏｔ 1和ｐｈｏｔ 2蛋白都是植物向光性反应的光受体 ,它们也是调节叶绿体运动、开闭气孔和快速抑制黄化芽延长生长的蓝光受体。为了解ｐｈｏｔ 1和ｐｈｏｔ 2调节这 4个反应的机理 ,有必要了解其细胞和亚细胞定位。将编码融合的ｐｈｏｔ 1和ＧＦＰ(绿色荧光蛋白 )的结构 (在内源ＰＨＯＴ1启动子控制下 )转化无ｐｈｏｔ1的拟南芥…     

番茄ARF2蛋白的生物信息学分析与亚细胞定位

克隆番茄(Solanum lycopersicum) ARF2基因,并分析其分子特性和亚细胞定位,为研究其功能提供基础．通过生物信息学方法分析SlARF2基因编码蛋白的理化性质和分子特性．采用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF2基因全长,并构建与黄色荧光蛋白(YFP)融合的pBA-ARF2-YFP表达载体,进而再通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化到野生型番茄中,将得到的T1代转基因种子萌发,然后取根尖通过荧光显微镜观察了融合蛋白在活细胞内分布的特点．生物信息学分析结果表明,SlARF2是富含Ser、Leu、Gly和Pro以及具有ARF家族典型结构域的可溶性蛋白,其氨基酸序列与葡萄、木薯和拟南芥的同源性分别为70.08 %、66.94 %和60.87 %．经酶切和测序分析证实pBA-ARF2-YFP融合表达载体构建成功,此外,PCR分析表明融合蛋白在转基因植株中得到表达．经荧光显微镜观察,ARF2定位在细胞核中．表明转录因子SlARF2定位在细胞核中,对番茄果实发育和成熟起重要作用．     

PC-1增强受体酪氨酸激酶家族成员EphA3在前列腺癌细胞中的转录

为了研究前列腺癌相关基因(prostate and colon gene 1, PC-1）对受体酪氨酸激酶家族分子EphA3表达的影响,用RT-PCR、实时PCR和Western印迹检测表达不同水平PC-1的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中EphA3的表达情况. 发现PC-1可诱导EphA3基因表达上调. 采用荧光素酶实验检测PC-1对于EphA3启动子转录活性的影响,结果显示,PC-1对转录起始位点上游916 bp的启动子活性没有影响,而可增强转录起始位点上游2011 bp启动子的活性.对EphA3启动子－916 bp～－2　011 bp区域进行生物信息学分析,结果显示,此区域包含HSF、NF-1、Nkx-2、SP1和GATA-1等多种转录因子结合位点.实验结果表明,PC-1可通过影响EphA3启动子诱导EphA3基因高表达,其调控区域位于转录起始位点上游－2　011　bp至－916 bp之间,提示PC-1可能通过影响一些结合于此区域的转录因子来影响EphA3启动子的转录活性.     

PC-１基因表达增强C4-2B前列腺癌细胞生存

建立稳定表达外源PC-１基因的人前列腺癌骨转移C4-2B细胞模型,初步探讨PC- １基因表达对前列腺癌发展的影响.通过脂质体介导的方法,将融合PC-１基因的真核表达载体pcDNA3.1PC-１稳定转染C4-2B细胞,Western 印迹和RT-PCR技术,分别从蛋白水平和RNA水平确定外源PC-１基因表达. MTT和软琼脂集落形成能力等一系列方法,研究PC-１基因的功能,RT-PCR和实时定量PCR检测前列腺癌发生发展相关基因表达的变化. 结果表明,PC-１基因的高表达能够诱导雄激素受体（AR）调控基因和一系列重要的信号通路成员基因PSA、PSMA、NKX31、Jagged1、EphA3、SGEF和 NOTCH3等表达发生变化. 实验结果初步证明,PC-１基因表达在晚期前列腺癌中,以及在雄激素非依赖的转变中可以发挥作用,PC-１基因表达可调控一些重要信号通路.对PC-１基因功能深入研究将有可能为发现新的前列腺癌的诊断治疗分子靶标提供线索.     

大青杨PubZIP1基因的克隆及亚细胞定位与抗旱表达特性分析

从大青杨中克隆得到PubZIP1基因,通过基因测序结果可知,PubZIP1基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸。分析得出PubZIP1蛋白含有BZIP和DOG1两个结构域,其二级结构包括α-螺旋（62.50%）、无规卷曲（29.72%）、延伸链（5.56%）、β-折叠（2.22%）。通过亚细胞定位试验表明PubZIP1基因位于细胞核。通过qRT-PCR分析表明,在模拟干旱的不同7% PEG6000胁迫时间下,分析结果表明胁迫后PubZIP1基因在大青杨根中的表达量呈下降趋势。而在大青杨茎和叶片中的表达量呈上升趋势,尤其是在叶片中明显被诱导表达。预测该基因可能主要在叶片中表达并行使功能。     

新麦草IPT基因亚细胞定位、过表达载体构建及鉴定

摘要：为了验证IPT基因在新麦草中的功能,研究以DT型和ST型的新麦草分蘖节为材料,通过RNA-seq分析和qRT-PCR试验验证IPT的相对表达量并进行GO富集分析,采用PCR法克隆IPT基因,构建1300-cYFP-IPT过表达载体,并进行生物信息学分析;通过烟草瞬时转染法和蛋白质印迹法鉴定IPT蛋白的亚细胞定位及表达情况。结果显示：IPT与tRNA二甲基烯丙基转移酶活性相关,在新麦草分蘖中起上调作用;克隆得到新麦草IPT基因全长,并构建了1300-cYFP-IPT过表达载体,其开放阅读框（ORF）为1362bp;多序列比对与保守结构域分析表明,新麦草IPT蛋白存在PLN02840蛋白保守结构域,与二粒小麦、小麦及硬粒小麦IPT蛋白的亲缘关系较近;蛋白质二级结构预测显示新麦草IPT蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠和不规则卷曲组成;分析显示丝氨酸的磷酸化位点最有可能是蛋白发挥功能的潜在磷酸化位点;烟草瞬时转染显示IPT蛋白正常表达,定位于叶绿体中;Western blot结果显示连接载体的目的蛋白IPT正常表达,大小为76.8kDa。研究表明IPT基因在新麦草分蘖过程中上调分蘖数,1300-cYFP-IPT载体可在植株叶绿体中正常表达;该研究为后续新麦草IPT基因进一步功能验证提供试验材料和理论依据。     

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.