CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞的流式分选及其肿瘤干细胞特性的初步鉴定

目的:通过表面标志分选法富集乳腺癌干细胞,并初步鉴定其肿瘤干细胞特性.方法:采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞,并进行干细胞比例分析;用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物Oct-4、SOX-2、CK-18和α-SMA的表达状态.结果:分选获得的CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞阳性比例达90％以上;免疫荧光检测结果显示,CD44+CD24-Λow细胞亚群比non-CD44+CD24-Λow细胞亚群高表达干细胞转录因子Oct-4、SOX-2,低表达分化因子CK-18、α-SMA;体外实验表明,CD44+CD24-Λow细胞亚群具有更强的成球生长能力,并具有双向分化潜能.结论:CD44+CD24-Λow表面标记物分选的方法可以富集高纯度的乳腺癌干细胞,且呈现干性因子Oct-4和SOX-2高表达.     

小鼠血管壁CD34+干细胞的分离、培养及鉴定

血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells, VW-SCs)在维持血管正常功能以及损伤血管的修复过程中发挥着关键性的作用,对其功能特性的研究将有助于干细胞的调控及应用。本文旨在建立稳定的VW-SCs分离、培养及分选鉴定技术,为进一步深入研究VW-SCs在生理和疾病状态下的增殖、迁移和分化等机制提供丰富、可靠的细胞来源。首先利用组织块贴壁法获取小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁细胞,传代培养到细胞数量至少达到1×10⁷后经磁珠分选和流式细胞术鉴定CD34⁺的VW-SCs;其次采用细胞免疫荧光染色检测干细胞标志物(CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1)以及平滑肌标志物(SM22、SM MHC)、内皮标志物(CD31)和细胞核内分裂增殖相关蛋白(Ki-67);血管壁CD34+干细胞的定向分化采用EBM-2内皮分化诱导培养基和FM-2成纤维细胞培养基分别培养7天和3天;利用细胞免疫荧光染色和q-PCR检测内皮细胞标志物(CD31, VWF)和成纤维细胞标志物(Vimentin, PDGFRα)的表达。此外...     

乳腺癌肿瘤干细胞的研究进展

干细胞(stem cell,SC)是一类具有自我更新、多向分化潜能的特殊细胞群体.而肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)不仅具备了干细胞方面的特征,同时还有其自身特殊性.乳腺癌中肿瘤干细胞的发现为乳腺癌的治疗提供了创新性策略.近年来,有关乳腺癌肿瘤干细胞的筛选标记和方法以及信号转导通路方面的研究颇多,但其中也不乏争议.就乳腺癌干细胞研究的最新进展作一端述.     

乳腺癌干细胞分子特性及其治疗新策略

乳腺癌是一种严重影响女性健康甚至危及生命的疾病。环境、饮食习惯、疾病等均有可能诱发人类乳腺细胞癌基因活化或抑癌基因失活,其诱发过程可通过细胞、动物模型所证实。最新研究指出,乳腺癌肿瘤干细胞的分子特性研究为乳腺癌发生、发展的认识提供了重要的佐证。另外,MicroRNAs在乳腺癌中表现促进或抑制瘤细胞生长与分化。这些研究的深入开展将为乳腺癌的防治提供新思路。     

磁珠分选HepG2细胞系中CD44~+及其生物学特性

背景:肝癌肿瘤干细胞被认为肝癌增值、侵袭、浸润的关键细胞。目的:研究人肝癌Hep G2细胞系CD44+细胞的分化、增值及小鼠模型致瘤性等生物学特性。方法:磁珠分选Hep G2细胞系中的CD44+和CD44-细胞亚群;微球形成实验检测两亚群细胞的干细胞特性及增殖能力;移植种瘤实验检测两亚群细胞致瘤性和恶性程度的差异。结果及结论:微球形成实验表明CD44+细胞具有干细胞特性;移植瘤致瘤性实验表明CD44+的致瘤率高,恶性程度高。提示HEPG2细胞系中存在具有增殖、多向分化与体内致瘤能力的CD44+细胞,CD44+细胞是符合肿瘤干细胞定义的细胞亚群。     

CD44~+CD24~(-/low)与ALDH1~+作为乳腺癌干细胞标志物之异同

越来越多的研究表明,CD44+CD24-/low与ALDH1+都是乳腺癌干细胞标志物。CD44+CD24-/low细胞与ALDH1+细胞具有很多相同的性质,但又有不同的性质和特点。该文主要就CD44+CD24-/low与ALDH1+之间的相同点、两者在乳腺癌干细胞特性方面的差异及其与乳腺癌基因亚型、预后、转移和耐药之间的不同关系等方面作一综述。     

可溶性Jagged-1/Fc嵌合蛋白诱导淋巴结细胞向CD4+CD25+ T细胞分化

直接用可溶性Jagged-1/Fc嵌合蛋白(Jagged-1/Fc)在体外诱导小鼠淋巴结细胞向CD4 CD25 T细胞分化.通过荧光标记单克隆抗体染色结合流式细胞术,观察不同剂量Jagged-1/Fc在不同时间对淋巴结细胞向CD4 CD25 T细胞分化的影响,观察Jagged-1/Fc诱导T细胞内细胞因子的变化;藉ELISA法检测Jagged-1/Fc诱导分化的T细胞分泌TGF-β1、IL-4和IL-10的水平.结果显示,超过500.0μg/L剂量的Jagged-1/Fc使CD4 CD25 T细胞百分比明显增高,诱导时间需要4～6天,抗Jagged-1单抗能抵消Jagged-1/Fc的诱导作用,用DAPT阻断Notch信号通路的活化也能抑制Jagged-1/Fc的诱导作用,Jagged-1/Fc诱导分化的T细胞培养上清中IL-4和IL-10的水平明显增高,TGF-β1无明显变化,胞内IL-4,IL-10,IL-2和TNF-α的水平也呈增高趋势.上述结果表明,可溶性Jagged-1/Fc嵌合蛋白在体外可诱导小鼠淋巴结细胞向CD4 CD25 调节性T细胞分化.     

三阴性乳腺癌干细胞的富集及CD44+CD24-/low、CXCR4表达测定

目的:探讨MDA-MB-231细胞经无血清培养富集三阴性乳腺癌干细胞,观察再成球、集落形成及CD44+CD24-/low、CXCR4表达。方法:将MDA-MB-231乳腺癌细胞进行微球体培养,取培养第7-9天的微球体,判断干细胞富集的程度;比较不同细胞浓度对癌球细胞成球率影响;流式细胞仪测定CD44+CD24-/low含量;Western blot法分析CXCR4蛋白表达;单个癌球细胞再成球能力;观察癌球与贴壁细胞集落形成。结果:1).在含20 ng/m L EGF,10 ng/m L b FGF,2%b27无血清培养基中可培养三阴性乳腺癌癌球,1×104/m L、2×104/m L、3×104/m L、4×104/m L、5×104/m L细胞浓度癌球细胞成球率分别为(5.61±0.02)%、(3.23±0.54)%、(2.28±0.48)%、(1.05±0.13)%、(0.91±0.01)%,组间比较差异有统计学意义P值均0.05。2).贴壁MDA-MB-231细胞与癌球细胞CD44+CD24-/low含量分别为(38.54±2.00)%VS(66.35±2.06)%,差异有统计学意义P=0.003。3).癌球细胞CXCR4蛋白表达高于贴壁MDA-MB-231细胞,灰度扫描分析差异有统计学意义,P=0.03。4).单个癌球细胞具有再成球能力。5).软琼脂糖集落形成能力癌球需200个细胞即可见集落形成,而贴壁细胞需1 000个MDA-MB-231细胞。结论:1.通过无血清培养可以富集三阴性乳腺癌干细胞,低细胞密度有利于癌球形成。2.癌球中CD44+CD24-/low含量高于贴壁MDA-MB-231细胞。3.CXCR4在癌球中表达高于贴壁MDA-MB-231细胞。     

喘息性支气管炎患儿外周血CD4+CD25+CD127low 调节性T细胞及淋巴细胞亚群的改变与临床意义

目的探讨喘息性支气管炎患儿外周血CD4~+CD25~+CD127~(low)调节性T细胞及淋巴细胞亚群数量变化与临床意义。方法选取我院16例喘息性支气管炎患儿、同期住院的25例支气管肺炎患儿和18例患有肾结石等非感染性疾病患儿为研究对象,采用流式细胞术分别检测3组患儿外周血中CD4~+CD25~+CD127~(low)调节性T细胞及淋巴细胞亚群百分比。结果喘息性支气管炎患儿外周血中CD4~+CD25~+CD127~(low)/CD4~+(Treg)比例(9.2%±2.1%)高于支气管肺炎组(6.9%±1.4%)和对照组(5.8%±2.2%),差异有统计学意义(F=16.5、17.7,均P0.01)。喘息性支气管炎患儿CD8~+百分比(19.7%±7.8%)低于支气管肺炎组(27.0%±8.8%)和对照组(30.7%±4.4%),差异有统计学意义(F=6.6、22.4,均P0.01)。喘息性支气管炎患儿B淋巴细胞百分比(33.4%±15.2%)高于支气管肺炎组(22.7%±6.9%)和对照组(17.7%±9.9%),差异有统计学意义(F=9.2、10.9,均P0.01)。结论喘息性支气管炎患儿外周血淋巴细胞亚群比例异常,体内存在免疫功能紊乱,CD4~+CD25~+CD127~(low)调节性T细胞可能参与喘息性支气管炎的发生发展。     

CD4+CD25+Foxp3hi细胞在夏氏疟原虫感染DBA/2小鼠作用研究

利用调节性T细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型,探讨DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS感染易感性的原因。DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS易感,伴随原虫血症增加CD4+CD25+Foxp3+细胞数量明显增加,且以CD4+CD25+Foxp3hi增加更为明显。原虫血症达峰值时CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量亦达到峰值。相比,Treg消除鼠的原虫出现时间和疟血症峰值时间均明显延迟,且在疟血症达峰值前(5～8 d)原虫血症水平明显低于对照组。与之相应,CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量明显处于低水平。同时,Treg消除鼠生存期明显延长。由此提示,P.c chabaudi AS感染导致Foxp3表达增加,扩增的CD4+CD25+Foxp3hi细胞有利于疟原虫复制和逃避宿主免疫应答,进而影响疟疾感染的进程和最终结局。     

体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞

对比MNC和CD34⁺富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性,发现：CD34⁺富集细胞具有很高的扩增潜力,在本实验条件下其总细胞持续扩增了8周,扩增倍数达31270.9±8640.5倍;而MNC在培养至第4周扩增就已呈现下降趋势,最大仅扩增了53.3±6.2倍。对比集落和CD34⁺细胞的扩增发现,MNC的集落密度和CD34⁺细胞含量由第0天至第7天有一个上升的过程,而CD34⁺富集细胞在培养过程中,集落密度和CD34⁺细胞含量却始终呈下降趋势。在体外培养过程中,CD34⁺富集细胞的CFU-GM和CD34⁺细胞最大分别扩增了185.7±14.1和191.7±188.8倍,明显高于MNC的12.4±3.2和50.6±33.2倍;而CD34⁺富集细胞和MNC的BFU-E则只实现了少量扩增,分别为7.2±5.2和10.1±3.4倍。结果显示,从CD34⁺富集细胞出发扩增造血干/祖细胞,可以得到更多的CD34⁺细胞和CFU-GM集落形成细胞。      

组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+ T细胞分化的影响

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）对外周CD4⁺ T细胞分化及功能的调控作用。方法 采用CD4cre酶介导Hdac3杂合基因缺失小鼠（Hdac3^fl/flCD4^cre+/-）及其野生型正常对照小鼠（Hdac3^fl/fl，WT），流式细胞术检测HDAC3缺失对外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例和数量的影响；在体外佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）刺激条件下，流式细胞术检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-17A的表达以及Tfh细胞产生的影响；采用ELISA检测HDAC3缺失对小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17表达的影响；分选Hdac3^fl/flCD4^cre+/-和WT小鼠外周初始CD4⁺ T细胞，分别在Th1和Th2分化条件下培养，细胞内染色检测HDAC3缺失对Th1、Th2以及Th17相关细胞因子及其特异转录因子表达的影响；采用Microarray检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞分化亚群相关基因表达的影响；采用链脲佐菌素（STZ）处理小鼠构建I型糖尿病（TIDM）疾病模型，检测HDAC3缺失对T1DM发病的影响。结果 与WT小鼠相比，Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例和数量显著降低。Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠CD4⁺ T细胞及血清中IFN-γ的表达显著降低，而IL-4和IL-17A的表达显著增加，Tfh细胞比例也显著增加；HDAC3缺失抑制体外培养CD4⁺ T细胞向Th1分化但促进其向Th2分化；Microarray检测发现HDAC3缺失导致Th1型细胞谱系基因表达降低，而Th2、Th17以及Tfh细胞谱系基因表达增加；在STZ诱导条件下，HDAC3缺失抑制小鼠T1DM的发生和CD4⁺ T细胞向Th1分化。结论 HDAC3促进外周CD4⁺ T细胞向Th1细胞分化并加重T1DM的发生。     

益生菌联合布地奈德对支气管哮喘患儿的疗效及对外周血CD4+和CD8+细胞水平的影响

研究益生菌联合布地奈德对支气管哮喘患儿的疗效及对外周血CD4⁺和CD8⁺细胞水平的影响, 为该类患者的治疗提供参考。

选择2019年6月至2020年5月我院收治的92例支气管哮喘患儿为研究对象, 按照随机数字表法分为观察组(益生菌联合布地奈德治疗)和对照组(布地奈德治疗)各46例, 比较两组患儿疗效、临床症状消失时间、治疗前及治疗4周后T淋巴细胞(CD4⁺、CD8⁺)和肺功能[用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、最大呼气峰流速(PEF)]水平。

治疗4周后, 两组患儿总有效率比较差异无统计学意义(93.48%vs 89.13%, χ²=0.137, P=0.711)。观察组患儿咳嗽消失时间、气促消失时间、哮鸣音消失时间、憋喘消失时间均显著低于对照组(均P < 0.05)。治疗4周后, 观察组患儿CD4⁺细胞水平显著低于治疗前及同期对照组, CD8⁺细胞、肺功能(FVC、FEV1、PEF)水平显著高于治疗前及同期对照组(均P < 0.05)。

益生菌联合布地奈德对支气管哮喘的疗效显著, 能够促进患儿临床症状恢复, 改善患儿肺功能, 下调外周血CD4⁺细胞水平, 上调CD8⁺细胞水平。

     

唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15促进结直肠癌细胞增殖和迁移并抑制肿瘤组织中CD4+与CD8+T细胞浸润

唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15(sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin-15,Siglec-15)属于Siglecs家族的一员,是一种新型免疫抑制分子。Siglec-15在多种人类肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞中高表达,但Siglec-15在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的生物学功能及其对免疫微环境的影响尚不明确。本文旨在分析Siglec-15异常表达对CRC细胞功能及CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞浸润的影响。首先,分析TCGA数据库中结直肠癌与正常组织中Siglec-15 mRNA表达水平,并对52例人CRC与配对癌旁组织进行免疫组织化学染色(IHC),发现Siglec-15在CRC中的表达水平高于癌旁组织(P<0.01)。CCK8和划痕愈合结果显示,敲低Siglec-15能抑制人CRC细胞SW480增殖(P<0.01)和迁移(P<0.05)。磁珠分选小鼠脾的CD8⁺T细胞并与小鼠CRC细胞MC38共培养,发现MC38细胞过表达Siglec-15能抑制CD8⁺T细胞对其的杀伤以及IFN-γ和TNF-α的分泌(P<0.01)。小鼠荷瘤结果表明,过表达Siglec-15可以促进小鼠肿瘤生长(P<0.05)。单样本基因集富集分析、荷瘤小鼠肿瘤组织及人结直肠癌组织IHC分析均表明,Siglec-15高表达时,肿瘤微环境中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞浸润减少(P<0.05)。综上所述,Siglec-15可能通过促进CRC细胞增殖迁移以及抑制CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞浸润促进结直肠癌进展。本文为探究Siglec-15在CRC中的免疫抑制作用提供了一些新的实验依据。     

诱导多能干细胞来源的肝细胞在HCV感染模型中的应用*

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)类似,是一类具有自我更新和无限增殖潜能的细胞, 并且能诱导分化为机体各胚层所有类型的细胞。因iPSCs来源于机体本身,规避了ESCs的免疫排斥和医学伦理等问题,具有极大的研究前景及应用潜能。大量研究表明,诱导多能干细胞分化的肝样细胞(iPS-derived hepatocyte-like cells,iHLCs)已广泛运用于HCV体内外感染模型的建立,并用于研究HCV的发病机制、宿主基因在HCV致病机制和筛选新型抗HCV药物及疫苗的研发。主要对iPSCs的来源、从不同策略诱导iPSCs成为功能性肝细胞的研究方法及其在HCV感染模型中的应用进行归纳总结。     

诱导多能干细胞来源的肝细胞在HCV感染模型中的应用*

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)类似,是一类具有自我更新和无限增殖潜能的细胞, 并且能诱导分化为机体各胚层所有类型的细胞。因iPSCs来源于机体本身,规避了ESCs的免疫排斥和医学伦理等问题,具有极大的研究前景及应用潜能。大量研究表明,诱导多能干细胞分化的肝样细胞(iPS-derived hepatocyte-like cells,iHLCs)已广泛运用于HCV体内外感染模型的建立,并用于研究HCV的发病机制、宿主基因在HCV致病机制和筛选新型抗HCV药物及疫苗的研发。主要对iPSCs的来源、从不同策略诱导iPSCs成为功能性肝细胞的研究方法及其在HCV感染模型中的应用进行归纳总结。     

促红细胞生成素通过提高Sca-1+干细胞的功能参与小鼠心肌梗死的修复(英文)

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是目前全球主要的死亡病因之一。随着临床治疗水平的提高,MI急性期的死亡率已显著下降,但其对心肌重构及心功能的长远影响仍无法有效防治。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种糖蛋白细胞因子,具有促进造血、抗凋亡和促血管生成的作用。研究表明EPO在心脏缺血损伤、心力衰竭等心血管疾病中发挥心肌保护作用,机制与促进心脏祖细胞活化有关。本研究旨在探讨EPO是否可通过增强Sca-1⁺干细胞的活性促进MI的修复。通过直接注射法将达贝泊汀-α (darbepoetin alpha,一种长效EPO类似物,EPO_anlg)注射到成年小鼠MI的交界区,观测MI面积、心脏重构及功能、心肌细胞凋亡及微血管密度变化。用磁性分选技术从新生和成年小鼠心脏中分离Lin^-Sca-1⁺干细胞,分别用于克隆形成能力及EPO效应的测定。结果显示,和单纯的MI组相比,在体应用EPOanlg可显著降低MI面积、心肌细胞凋亡率,减轻左室腔的扩张,同时提高心功能、增...     

Flk1+间充质干细胞减轻四氯化碳导致的肝纤维化的研究

许多慢性肝脏疾病都会发生肝纤维化,但是目前尚缺乏对肝纤维化切实有效的治疗手段。实验发现,Flk1(fetalliverkinase)阳性间充质干细胞(MSC)能够减轻四氯化碳(CCl₄ )所致小鼠肝纤维化。取雄性BALB c小鼠骨髓,分离培养Flk1⁺ MSC ,用CCl₄ 制作雌性小鼠肝纤维化模型,在CCl₄ 损伤后立即或1周后经尾静脉注射Flk1⁺ MSC ,2或5周后检测受体小鼠肝脏的纤维化程度和供体细胞的植入。结果发现,CCl₄ 损伤后立即注射Flk1⁺ MSC ,可以使肝脏损伤程度明显减轻,减少胶原沉积,使肝脏羟脯氨酸含量及血清纤维化指标显著下降;而损伤1周后注射细胞则无明显变化。免疫荧光、PCR和荧光原位杂交方法证实,在受体肝脏中有供体细胞植入,呈上皮细胞形态,并表达白蛋白,但是数量很少。因此,Flk1⁺ MSC具有潜在的植入肝组织的能力,并可能启动肝组织的内源性修复,减轻CCl₄ 导致的肝纤维化。     

三阴乳腺癌CD44~+/CD24~(-/LOW)细胞与CXCR4表达的临床意义

目的探讨CD44+/CD24-/low表型在三阴乳腺癌中的临床病理意义以及与CXCR4表达的相关性。方法根据ER、PR、Her-2表达情况将118例乳腺癌分为三阴及非三阴组,应用免疫组织化学检测其CD44、CD24及CXCR4表达情况,分析CD44+/CD24-/low表型及CXCR4在三阴乳腺癌中表达情况及其与临床病理的关系。结果 34例三阴乳腺癌肿瘤细胞CD44+/CD24-/low表型阳性率为55.9%,CD44+/CD24-/low阳性与一般临床特征不相关,但与远处转移或复发密切相关。CXCR4的表达与CD44+/CD24-/low阳性细胞成正相关。结论三阴乳腺癌的复发和远处转移可能与CD44+/CD24-/low较高的表达率有关,并且可能是由CXCR4介导的。     

调控软骨形成的信号通路及相关因子在骨髓间充质干细胞骨向分化中的作用*

骨髓间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞,可以通过定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是目前骨再生医学和细胞治疗研究最多的理想种子细胞。在骨缺损的修复过程中,骨髓间充质干细胞内成软骨相关基因表达升高进而分化为软骨细胞,后期随着成骨细胞和破骨细胞的形成及血管长入,软骨基质逐步降解并被骨基质所替换。软骨细胞参与了骨缺损前期的修复过程,调控软骨形成的信号通路及相关因子不仅调控骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化,同时在成骨细胞分化过程中也发挥着重要的作用。对调控软骨形成的信号通路及相关因子在骨髓间充质干细胞骨向分化中的调控作用和研究现状进行了总结,以期为临床寻找更好的治疗骨缺损的方法提供理论依据和研究方向。