发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

拟南芥CBF2基因的抗旱性研究

以拟南芥为材料,根据已报道的序列设计引物克隆了CBF2基因及rd29A基因启动子,并构建了植物表达载体pBI-rd-cbf,用以转化烟草。转基因烟草的Northern杂交检测显示,30%PEG诱导条件下CBF2基因在诱导30 min之后持续较高的表达水平,且表达水平受胁迫诱导程度的影响。抗旱生理指标测定显示,干旱条件下转基因烟草植株的脯氨酸含量迅速增高,远超于野生型;而丙二醛含量的增长幅度要比野生型植株小很多,且随着胁迫时间的延长,转基因植株体内的丙二醛含量逐步趋于稳定。试验证明,CBF2基因在提高农作物的抗旱性方面具有极大的利用价值。     

过表达NtMYB4a基因增强烟草抗旱能力

为探究转录因子NtMYB4a参与调控烟草(Nicotiana tabacum)抵抗干旱胁迫的能力,以NtMYB4a过表达株系(OE)、敲除株系(KO)和野生型(WT)为材料,通过盆栽实验模拟自然干旱胁迫,对比分析三个株系在干旱胁迫0、2、4、6、8 d和复水2 d后的光合特征、根系活力、叶绿素、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量以及抗氧化酶活性等指标。结果表明,OE株系的净光合速率(Pn)、根系活力、叶绿素含量、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性均显著高于WT株系,而蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、MDA含量则显著低于WT株系;KO株系多数时期Pn、根系活力、叶绿素含量、Pro含量及SOD、POD和CAT活性显著低于WT株系,Tr、Gs、MDA含量则显著高于WT株系。因此,超表达NtMYB4a可能通过提高烟草的光合能力、根系活力和抗氧化酶活性,减少细胞膜损伤来提高烟苗抗旱性。     

拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得

植物体内的α,β-不饱和活性醛类化合物对植物细胞具有毒害作用,清除这些α,β-不饱和活性醛类化合物对于植物细胞维持正常的生命活动至关重要。前人研究报道通过体外酶活测定和异源瞬时表达鉴定拟南芥 At3g04000基因编码的蛋白为 NADPH 依赖的叶绿体醛还原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs),推测其在清除叶绿体中长链(≥5)α,β-不饱和醛类物质中具有重要的功能。该研究主要构建了拟南芥 At3g04000基因的表达模式分析载体 ProAt3g04000：GUS、亚细胞定位分析载体At3g04000-EGFP 和过量表达载体 At3g04000-OE,并获得了转基因拟南芥,并通过实时定量 PCR 分析了At3g04000基因在拟南芥不同组织中的转录水平。结果表明：拟南芥 At3g04000基因在幼苗中的转录水平最高,在莲座叶、茎生叶、花序和角果中均有较高的转录水平;而在根部和茎秆中的转录水平较低。通过对ProAt3g04000：GUS 转基因植株的 GUS 染色分析可知,At3g04000基因在子叶、莲座叶和萼片的维管组织和保卫细胞中均有较强的表达,在根的维管组织中有较弱的表达。通过共聚焦显微镜对 At3g04000-EGFP 转基因植株的观察和分析发现,At3g04000不是定位于叶绿体中,而是定位在细胞质和细胞核中。该研究结果为深入研究拟南芥醛还原酶编码基因 At3g04000的功能奠定了基础。     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用ＰＣＲ技术,从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＣＢ１２５染色体中重新扩增得到含有２－酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２－ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＢＨ５α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到ｔｋｒＡ内部使其突变失活     

H_2O_2胁迫锻炼对小麦幼苗抗旱性的影响

12 d龄的春小麦幼苗在 1 mmol· L- 1及 1 0 mmol· L- 1H2 O2 的胁迫锻炼过程中 ,质膜透性增大 ,O- · 及 H2 O2 含量增多 ,CAT活性升高 ,叶绿素含量降低 ,低浓度 H2 O2 胁迫使SOD活性上升 ,高浓度时却使其活性下降。经过 H2 O2 胁迫锻炼后的小麦遭受干旱胁迫时 ,叶绿素含量、SOD活性、CAT活性均高于对照组 ,而质膜透性、O- · 及 H2 O2 含量却低于对照组。表明 H2 O2 胁迫锻炼 ,提高了小麦幼苗的抗氧化能力 ,增强了其抗旱性     

淹水对转超氧化物歧化酶或过氧化物酶基因烟草某些生理生化指标的影响

对盆栽十二叶龄的3个烟草近等基因系进行淹水处理后的结果表明:随着淹水时间的延长,细胞质膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均显著升高;叶绿素和可溶性蛋白质含量、株高、叶片数及生物量均下降.各种指标在短时间内不能恢复到正常水平或者根本不能恢复.3个品系抗涝性强弱依序为:转基因抗坏血酸过氧化物酶(APX)高表达品系＞转Mn-SOD基因叶绿体高表达品系＞非转基因品系.     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2酮基醛糖还原酶A和B(2KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR322上,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2酮基古龙酸(2KLG)打下基础。     

海洋细菌Bacillus sp.2-羰基还原酶的纯化和性质

从一株海洋细菌Bacillussp .中通过硫酸铵分级盐析、QSepharoseFF阴离子交换层析、Hydroxyapatite柱层析和SephadexG 1 0 0凝胶过滤 ,分离纯化出一种 3 脱氧葡糖醛酮代谢酶 ,定性为 2 羰基醛还原酶。以粗酶液作起始 ,所获样品纯度提高 1 41 4倍 ,活力回收率 1 1 4%。 2 羰基醛化合物对该酶是特异性很好的底物 ,该酶对 3 脱氧葡糖醛酮的Km为 2 5mmol L ,分子量约为 33kD ,反应最适pH为 6 2 ,在pH5 0～ 8 0 ,温度 30℃以下酶活保持稳定。适量的ED TA、巯基乙醇或二硫苏糖醇能提高酶的活性 ,碘乙酸、N 乙基顺丁烯二酰亚胺均造成酶部分失活。     

类固醇5-α还原酶样基因Srd5α2l2的克隆及表达分析

采用表达序列标签（EST）介导的基因克隆和表达谱分析,从小鼠心脏克隆了一个cDNA为2 348 bp,主要在心脏表达的新基因Srd5α2l2（GenBank Acc No.AF548365）.该基因由12个外显子组成,3′非翻译区富含ATTTA序列,最大开放阅读框编码一个由361个氨基酸组成的假定蛋白,该蛋白质C端含有类固醇5-α还原酶的保守结构域（3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase,STEROID_DH）.生物信息学分析表明,人cDNA 克隆DKFZp313D0829（AL833108）是Srd5α2l2的人同源基因.经同源性检索,支持Srd5α2l2的全部41条EST中25条来自小鼠心脏组织.RT-PCR检测初步证实,该基因主要在心脏中表达,而在其他组织中不表达或弱表达.综合考虑Srd5α2l2的序列特征和表达谱,Srd5α2l2可能在心脏组织中发挥重要作用.     

烤烟品种抗旱性的早期鉴定技术研究

通过固体平板培养技术,研究烟苗在干旱胁迫条件下与抗旱性密切相关的指标,对5个烤烟品种进行了抗旱性鉴定,并用隶属函数法对烤烟品种的抗旱性进行综合评价。结果表明,同一烤烟品种在干旱胁迫与正常条件下相比,其鲜重、主根长、侧根总长、根系活力、叶绿素含量及质膜透性差异显著,鲜重、侧根总长及质膜透性可作为烤烟抗旱性的敏感指标;不同烤烟品种的抗旱性有明显差异,5个品种抗旱性大小表现为:NC82 > RG11 > 红花大金元 > G28 > K326。本技术可用于烤烟品种抗性筛选。     

过表达胡杨XTH基因能够提高烟草抗旱性

胡杨是典型的抗旱树种。挖掘和鉴定胡杨的耐旱基因对于提高植物抗旱性具有重要意义。木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）是植物细胞壁重构过程中的关键酶,在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。我们前期已从胡杨叶片中克隆了PeXTH基因。本文利用Real-time PCR检测PeXTH基因在干旱胁迫下的表达水平。在此基础上,构建植物表达载体pMDC85-PeXTH,通过农杆菌介导法将PeXTH基因转入烟草,分析过表达PeXTH基因烟草的抗旱性。研究发现,胡杨叶片中PeXTH基因的表达受干旱胁迫诱导。干旱处理后,转PeXTH基因烟草的萌发率明显高于野生型烟草;与野生型植株相比,转基因植株的叶片失水速率明显降低。干旱胁迫下,转基因烟草的气孔开度仅为野生型烟草的51.2%～53.6%。结果表明,过表达PeXTH基因能够提高烟草的抗旱性。本研究丰富了对胡杨PeXTH基因功能的认识,为植物抗旱分子育种提供了重要的基因资源。     

过表达秋茄C2H2型锌指蛋白基因KcZFP提高烟草耐盐性

基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用.锌指蛋白是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色.本研究以秋茄C2H2型锌指蛋白编码基因KcZFP为目的基因,在烟草中过表达KcZFP,分析C2H2型锌指蛋白在植物耐盐性中的作用.研究结果显示:转基因株系中,KcZFP表达量显著提高.过表达KcZFP的烟草植株的耐盐性明显提高,在200 mmol/L NaCl处理的条件下,KcZFP过表达烟草中脯氨酸水平远高于野生型植株.对光合作用参数比较分析显示,在KcZFP过表达植株中净光合速率受盐胁迫的影响小于野生型植株,光合系统在一定程度上得到了保护.研究结果说明KcZFP作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献.     

华南地区8种常见园林地被植物抗旱性比较研究

以华南地区8种常见园林地被植物为研究对象,在温室内设置盆栽控水试验,分组测定各参试植物的永久萎蔫率,叶片失水率、相对含水量、相对电导率、可溶性糖、脯氨酸以及丙二醛含量等生理生化指标,并用隶属函数法对其抗旱性进行综合评价。结果表明:(1)植物的永久萎蔫率和叶片失水率以鹅掌藤、白蝴蝶相对较低,其植株表现出较强的抗旱性。(2)随着持续干旱时间的延长,8种地被植物的叶片相对含水量呈不同程度下降趋势;叶片相对电导率、MDA含量均有不同程度升高;叶片可溶性糖和脯氨酸含量的变化趋势不一。(3)3种木本植物的抗旱性强弱依次为鹅掌藤>红花龙船花>红背桂,5种草本植物依次为水鬼蕉>蚌兰>白蝴蝶>葱兰>大叶红草。研究表明,植物的永久萎蔫率、叶片失水率、相对含水量、相对电导率、丙二醛含量与其实际抗旱性密切相关,可作为评价园林地被植物抗旱性的有效指标。     

干旱胁迫下CO2浓度升高对转StAPX番茄植株耐旱能力的影响

在干旱胁迫伴随大气CO2浓度以及升高的CO2浓度（加倍）条件下,以过量表达番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（StAPX）的转基因番茄为试材,探明干旱胁迫TCO2浓度升高对转基因及其野生型番茄植株清除活性氧及耐旱能力的影响。结果表明：升高的CO2浓度明显增加了干旱胁迫下植物的光合水平;升高的CO2浓度明显降低了干旱导致的植物体内H2O2．和O2的积累,影响了干旱胁迫下番茄植株的水．水循环系统的活性氧清除酶活性和小分子抗氧化物质含量;干旱胁迫下即使伴随升高的CO2浓度,测试番茄植株体内的渗透调节物质含量变化也不太明显;升高的CO2浓度明显降低了干旱胁迫下的植物细胞膜伤害程度;干旱胁迫下,升高的CO2浓度对转基因番茄株系比对野生型植株的影响更加明显。结果证明干旱逆境下,升高的CO2浓度能够在一定程度上进一步提高转基因番茄植株的耐旱性。     

干旱胁迫对不同烤烟品种根系生长和生理特性的影响

以抗旱型烤烟品种‘农大202'及一般型烤烟品种‘NC89'和‘K326'为材料,采用盆栽试验研究了干旱胁迫对根系生长和生理特性的影响,以明确各烟草品种的抗旱能力及其与根系生长和生理特性的关系.结果显示:严重干旱胁迫之后各烤烟品种根系鲜重、干重上升,而根系活力、根系吸收面积以及根系SOD和POD活性等根系生理指标则呈下降趋势.在干旱胁迫条件下,‘农大202'的根系总吸收面积、活跃吸收面积、根系活力、SOD活性和POD活性均显著高于两对照品种‘NC89'和‘K326',但其根系鲜重和干重等生物量并不具有太大的优势.研究表明,烟草的根系生长和生理特性对环境水分条件的响应存在明显的基因型差异;在干旱胁迫条件下, ‘农大202'根系能保持较高总吸收面积、活跃吸收面积、根系活力和保护酶活性,是其具有较强抗旱性的生理基础.     

干旱对上部烟叶细胞结构和化学成分的影响

研究了烟草在土壤含水量为１２％、１６％、２０％的条件下叶片栅栏组织细胞的结构和烟昔日 化学成分的变化规律。结果表明：干旱处理的烟草,叶片栅栏组织细胞内淀粉粒变小,数量变少。叶片中还原性糖、可溶性总糖和Ｋ２Ｏ含量增加,淀粉和烟碱含量减少。干旱程度越深,其变化趋势越明显。     

天山雪莲冷调节蛋白基因siCOR转化烟草植株的抗旱性分析

冷调节蛋白(cold regulated proteins, CORPs)是植物在冷驯化下产生的特异性蛋白, 与植物的抗寒性密切相关。然而, 大量研究表明, 绝大多数植物冷诱导基因同样会响应水分胁迫。采用半定量RT-PCR分析天山雪莲(Sasussured involucrata)冷调节蛋白基因siCOR的表达, 结果表明siCOR是一个受干旱胁迫诱导表达的基因。为研究siCOR基因是否与抗旱性相关, 以siCOR转基因烟草为研究材料, 利用水分胁迫处理进行抗旱性分析。结果表明与野生型(wild-type, WT)相比, 转siCOR植株叶片萎蔫较迟且程度较轻, 复水后恢复快且较完全; 其叶片相对含水量和PSII相对量子产率的降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株。采用PEG6000模拟干旱胁迫, 发现转siCOR植株T3代种子的萌发率较高, 主根生长的受抑制程度较野生型轻。以上结果表明, siCOR基因在植物对干旱胁迫的响应中起重要作用。