小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac和Bt制剂抗性的选育及其抗性种群的生物学适应性

用Bt制剂和Bt毒素Cry1Ac分别对源自深圳田间的小菜蛾Plutella xylostella在室内进行抗性种群选育,获得相对抗性倍数分别为24.36、38.16倍的抗性种群DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46。对这2个抗性种群及其敏感种群（DBM.Bt-S）的生长发育、存活及繁殖特征进行了详细地观察与比较,并以甘蓝为饲喂材料构建了2个抗性实验种群的生命表。结果表明,DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46种群较DBM.Bt-S种群的产卵量和孵化率下降,幼虫发育历期延长,雌雄比显著降低,雌成虫数量、寿命减少。DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46种群相对于DBM.Bt-S种群的相对适合度分别为0.75和0.65,抗性种群在繁殖能力上存在明显的生存劣势。     

二化螟Cry1Ac敏感和耐受品系的适合度差异及中肠蛋白酶活性比较

抗性/耐受种群的适合度代价和中肠蛋白酶活性研究是了解昆虫抗性进化、抗性产生的生理生化基础及抗性治理的重要内容。本研究以室内继代汰选的具有相同遗传背景的Cry1Ac耐受和敏感品系为研究对象,系统研究了两品系的适合度和中肠蛋白酶活性差异。研究结果表明,与敏感品系相比,耐受品系幼虫的存活率显著下降,且耐受种群不同日龄幼虫体重均低于敏感种群,20日龄时达显著差异;但两品系不同虫态的发育速度、蛹重、化蛹率、羽化率和成虫繁殖力均没有显著差异。中肠蛋白酶活性研究表明,耐受种群的类胰蛋白酶活性显著低于敏感种群,但两种群的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性没有显著差异。该研究对于识别蛋白酶介导的Bt抗性机制和昆虫Bt抗性治理均具有重要意义。     

Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选种群对其他Bt毒素的交互抗性

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée) 是危害玉米的重要害虫之一, 转Bt基因抗虫玉米为其防治提供了新的途径。然而, 靶标害虫产生抗性将严重阻碍Bt制剂及转Bt基因抗虫玉米的持续应用。明确害虫对转Bt基因玉米表达的毒素蛋白的抗性演化, 对于制定科学有效的抗性治理策略具有重要的理论和实际意义。本实验通过人工饲料汰选法研究了Bt Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选14代的种群对其他Bt毒素（Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa）的交互抗性, 并观察了Cry1Ie蛋白胁迫对亚洲玉米螟生物学的影响。结果表明： 随着汰选压不断提高, 亚洲玉米螟种群对Cry1Ie毒素的敏感性逐渐下降。汰选14代后, 种群对Cry1Ie毒素的抗性水平提高了23倍。然而, Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa对所获Cry1Ie汰选种群的毒力与对敏感种群的毒力相比没有显著差异, 说明Cry1Ie汰选没有引起亚洲玉米螟对Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa毒素产生交互抗性。同时, 与敏感种群相比, Cry1Ie汰选14代的种群幼虫平均发育历期延长5.7 d, 蛹重减轻13.7%, 单雌产卵量下降40.0%。本研究结果说明, 大面积单一种植转cry1Ie基因抗虫玉米, 可能引起亚洲玉米螟产生抗性; 亚洲玉米螟Cry1Ie抗性种群对Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa没有交互抗性, 含有cry1Ie和cry1Ab, cry1Ac或cry1F双/多基因抗虫玉米, 可作为靶标害虫抗性治理的重要策略。     

田间棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率

【目的】系统了解河南省新乡市田间棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)种群对Cry1Ac蛋白的敏感性变化,可为该虫的抗性治理策略提供重要的科学依据。【方法】采用单雌系F1/F2代并结合诊断剂量法于2013-2016年连续监测了河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率以及种群敏感度的变化。【结果】2013-2016年河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率小于0.002 12,抗性基因频率处于较低水平;种群的相对平均发育级别由2013年的0.506分别下降到2015和2016年的0.448和0.442,表明棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感度增加。【结论】河南省新乡市棉铃虫种群对转Cry1Ac基因棉花仍处于较为敏感阶段,转Bt基因棉花的种植面积在河南新乡地区的大面积缩小可能是其抗性发展缓慢的重要原因。     

东南沿海地区小菜蛾对Bt δ-内毒素和Bt制剂的抗性检测

采用浸叶法测定了2003年秋季、2004年春季采自广东惠州、福建福州、浙江杭州和江苏南京的小菜蛾Plutella xylostella田间种群对Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa以及Bt制剂kurstaki亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Btk）的抗性水平。与敏感品系PHI-S相比,广东惠州田间小菜蛾种群的抗性水平最高,其对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性分别达到了168和120倍,均为高抗水平; 对Btk制剂的抗性有47倍,达到了中抗水平;对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性 (分别为5.8和5.6倍)。福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群抗性水平相近,对Cry1Ab和Cry1Ac具有低至中等水平抗性 (8～28倍),对Btk制剂具有低水平抗性 (3.5～7倍),对Cry1Aa和Cry2Aa还没有产生明显抗性。因此,在我国东南沿海地区要注意Btk制剂与Bt其他亚种制剂或其他生物杀虫剂轮换使用,以减小Bt制剂对小菜蛾的选择压力,延缓小菜蛾对Bt抗性的发展。     

棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性及交互抗性研究

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性问题是阻碍Bt抗虫棉持续发展的关键,探究棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性演化趋势及交互抗性,可为选择合适的抗虫棉花备选基因提供参考。【方法】在室内通过连续多代筛选,获得了5个对Bt具有不同抗性的品系,利用饲料混合法测定了这些品系棉铃虫的交互抗性。【结果】经筛选后棉铃虫对Cry1Ac产生了超高水平的抗性、对Cry2Ab、Vip3Aa产生了超低抗性(耐性);Cry1Ac抗性棉铃虫停止筛选而换成Cry2Ab或Vip3Aa继续筛选后,棉铃虫对Cry1Ac抗性水平明显降低,对Cry2Ab或Vip3Aa产生低抗或超低抗性(耐性)。Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry1Ab敏感性显著降低,而对Cry2Ab、Cry2Ah及Vip3Aa敏感性变化不显著;Cry2Ab抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性显著降低;Vip3Aa抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性变化不显著。说明Cry1Ac与Cry1Ab间存在明显交互抗性,与Cry2Ah、Vip3Aa没有交互抗性;而Cry2Ab与Cry1Ac间存在不对称的交互抗性。【结论】在筛选新杀虫基因或叠加基因时,应充分考虑抗性发展及交互抗性问题,Cry2Ah、Vip3Aa是治理Cry1Ac抗性棉铃虫或与Cry1Ac叠加最优的选择。     

棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响

【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。     

棉铃虫田间种群Bt毒素Cry1Ac抗性基因频率的估算

采用改进的F₁筛查法检测了2005年采自华北地区的棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)田间种群对Bt毒素Cry1Ac的抗性基因频率。2005年从河南安阳和河北沧县转Bt基因抗虫棉上采集二代棉铃虫卵,在室内用人工饲料饲养至2龄幼虫,用1 μg/cm² 的Cry1Ac活化毒素进行初筛,将初筛存活成虫与室内筛选的GYBT抗性品系成虫进行单对杂交,并用区分剂量(2.5 μg/cm²)对F₁代进行检测。经检测,2005年河南安阳棉铃虫种群和河北沧县棉 铃虫种群对Cry1Ac抗性基因频率基本一致,分别为1.4×10^-3和1.5×10^-3。用毒素涂表法测定了2004、2005年采自河南安阳、河北高阳、河北沧县、新疆阿克苏和新疆沙湾棉铃虫田间种群对Cry1Ac活化毒素的敏感性水平,结果表明华北棉区与新疆内陆棉区棉铃虫种群对Cry1Ac的敏感性存在一定的地区性差异（<8倍）。总体上,我国华北棉区棉铃虫种群对Cry1Ac还未产生明显抗性,抗性基因频率处于正常水平。棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性风险依然存在,需要尽快启动全国性的早期抗性检测和预警工作。     

Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白对粘虫幼虫生长发育的影响

【目的】为探究Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata (Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的杀虫活性及对其生长发育的影响。【方法】本文通过浸叶法饲喂初孵及2龄末粘虫不同剂量的Cry1Ac及Cry2Ab杀虫蛋白后,观察其死亡率,称量幼虫重,并统计了幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率等指标。【结果】初孵幼虫取食浸泡含16、64、128μg/mLCry1Ac及Cry2Ab的玉米叶片后,随着时间的延长及浓度的增加,死亡率逐渐增加,且Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫的生物活性高于Cry2Ab蛋白,在128μg/mL浓度下,取食Cry1Ac和Cry2Ab蛋白13d时的死亡率分别达到了65%及60%。取食两种蛋白后,初孵幼虫和2龄末幼虫重量均受到显著抑制,短期取食两种蛋白对幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率没有影响。【结论】取食Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白后,对初孵幼虫有很好的杀虫活性,且Cry1Ac杀虫活性高于Cry2Ab杀虫蛋白;短期饲喂两种杀虫蛋白时,对2龄粘虫后期生长影响不大。本文结果为转Bt基因作物更好的应用于粘虫的防治提供了理论基础。     

Cry1Fa对Cry1Ac抗性棉铃虫的毒力评价

为了防治多种鳞翅目害虫, 表达Cry1Fa的转基因玉米和棉花已在美国商业化种植。明确棉铃虫Helicoverpa armigera对Cry1Fa与Cry1Ac的交互抗性及这两种杀虫蛋白之间的协同作用, 可以为表达 Cry1Fa+Cry1Ac的转双价抗虫棉花的合理应用提供依据。本实验测定了Cry1Fa对棉铃虫敏感品系（96S）及用Cry1Ac筛选的抗性品系（BtR, 抗性倍数2 194.15倍）的毒力, 发现Cry1Fa对敏感棉铃虫的毒力远低于Cry1Ac, LC₅₀值是Cry1Ac的504.80倍; 而且抗性品系BtR对Cry1Fa存在19.98倍的交互抗性。Cry1Fa与Cry1Ac混用可以提高Cry1Fa毒杀敏感棉铃虫的效果, 尤其是Cry1Fa浓度较低时, 加入Cry1Ac, 可以显著增加Cry1Fa的毒力; 但只有加入较高浓度的Cry1Fa时才能增加Cry1Ac的毒力。由于BtR品系已经对Cry1Ac产生抗性, Cry1Ac对抗性棉铃虫的毒力明显降低; 在较高浓度的Cry1Ac中加入Cry1Fa可以显著增加棉铃虫的死亡率（P=0.0015, F=6.88, df=6）, 但最高死亡率仅为58.33%。D-饱和最优试验的结果证实, Cry1Ac对于敏感棉铃虫的死亡率的影响达到显著水平（t₁=13.76﹥t_0.05）, Cry1Ac与Cry1Fa的交互作用对毒力的影响也达到显著水平（t₂₂=2.42﹥t_0.05; t₁₁=6.95﹥t_0.05; t₁₂=3.43﹥t_0.05）。Cry1Ac和Cry1Fa对抗性棉铃虫死亡率的影响都达到显著水平（t₁=3.03﹥t_0.05;t₂=2.59﹥t_0.05）, 但Cry1Ac是决定抗、 感棉铃虫死亡率的关键因素; Cry1Ac与Cry1Fa最佳浓度配比范围都是1.41~2.10 μg/cm2; 在抗性品系中, Cry1Ac和Cry1Fa的交互作用不显著。所以, 尽管Cry1F+Cry1A作物扩大了杀虫谱, 但棉铃虫对这两种蛋白存在交互抗性, 而且这两种蛋白混用对治理抗Cry1Ac棉铃虫的效果不理想, 因此不建议在中国种植表达Cry1F+Cry1A的棉花。关