斜纹夜蛾核型多角体病毒不同分离株基因序列的同源性分析

研究SpltMNPV不同分离株及SpltMNPV分离株与SpliNPV间基因序列的同源性,为SpltMNPV分离株的利用提供理论基础。根据已发表的斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltMNPV）中国株（Zh）基因组全序列（AF527603）和海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SpliNPV）Not I-D片段序列（AF527603）设计引物,PCR方法扩增得到SpltMNPV日本福冈株（Fu）、埃及株（Eg）和小笠原株（Og）的ORF39～ORF42和ORF119～ORF124编码区全序列。SpltMNPV不同分离株及SpltMNPV分离株与SpliNPV间基因序列的相似性比较, Zh株和Og株,Eg株、Fu株和SpliNPV的相似性高,而Zh株和Eg株、Fu株或SpliNPV,Og株和Eg株、Fu株或SpliNPV的相似性都比较低。亦即SpltMNPV 3种基因型,B型和C型的同源性高,A型与B型或C型的同源性比较低,但A型与SpliNPV的同源性高;同一基因型内不同分离株（Eg株和Fu株）的同源性高。ETG分子进化分析表明Eg株、Fu株和SpliNPV处于一个分支,而Eg株、Fu株和SpliNPV与Zh株和Og株则处于不同的分支。因此推断Eg株和Fu株为SpliNPV的分离株,而Og株为SpltMNPV的分离株。     

文摘

010001小麦品质性状的遗传及其遗传改良中，综刘广田…农业生物技术学报．－200084．－307～314综合评述了小麦品质性状的研究现状、方法及其遗传改良。文中详细介绍了小麦品质性状的遗传规律、分子标记及其与品质的关系。（孙雷心）010002斜纹夜蛾核多角体病毒基因组DNAXbaI2．0kb片段全序列分析中胡国栋…农业生物技术学报．－200084．－315～319文中报道了斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltNPV）基因组DNAXbaI2．0kb片段的核苷酸全序列。该序列包括3个完整的读码框和1个不完整的读码框，即ORF1、ORF2、ORF3和OR…     

C型斜纹夜蛾核型多角体病毒X17病毒株部分基因的序列分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus, SpltMNPV）X₁₇株是采用活体克隆法自SpltMNPV日本小笠原株分离的病毒克隆。为了揭示X₁₇病毒株基因型, 根据已发表的SpltMNPVⅡ基因组全序列（GenBank登录号： NC_011616）设计引物, PCR扩增多角体蛋白基因（polh）, 并与SpltMNPV不同基因型及37种其他核型多角体病毒（NPV）作分子进化比较。系统发育树显示： SpltMNPV分为SpliNPV（A）型、 SpltMNPV（B）型和SeMNPV（C）型3种基因型, 此结果与前人利用基因组酶切图谱的研究结果一致。X₁₇与SpltMNPV-1和SpltMNPVⅡ处于一个分支, 属于SeMNPV（C）基因型, 与A型和B型相距较远。此外, 扩增了X₁₇病毒基因38.7kD,Lef-1,Lef-9,fp,p10和p74, 并与SpltMNPV, SpltMNPVⅡ, SeMNPV和SfNPV的同种基因进行同源性比较。结果表明, 基于这6个ORF, X₁₇与SpltMNPV同源性最低, 其中Lef 9的氨基酸序列一致性最高, 也仅为69%, 38.7kD的氨基酸序列一致性只为26%。多数基因X17与SpltMNPVⅡ和SeMNPV的同源性较高, 其中fp25K的氨基酸序列一致性最高, 分别达95%和96%; 但也有些基因同源性较低, 如38.7kD的氨基酸序列一致性均为64%。因此, X₁₇应是SpltMNPV C基因型的一种新毒株, 命名为SpltMNPVⅡ-1。该研究为X₁₇病毒株的进一步研究利用奠定基础。     

斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)基因组EcoR I-G片段的序列分析

斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)基因组EcoR I-G片段全长7 450bp,包括7个开放读码框vp39、lef-4、cg30、p91、vp33、tlp20、AcMNPV ORF81同源基因和一个同源区(hr).基因组排列比较分析发现,这些基因在基因组中的排列,在所有已知序列的杆状病毒中都比较保守.     

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)

克隆了棉铃虫Helicoverpaarmigera单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)C1株基因组DNA ,并通过随机测序的方法测定了经XbaI酶切后的H片段的核苷酸全序列。序列比较和分析发现该片段中ORF1 3与苜蓿丫纹夜蛾Autographacalifornica多粒包埋型核型多角体病毒 (AcMNPV)基因组ORF1 47(ie 1 )同源。ie 1基因编码区全长 1 986bp ,根据推测的氨基酸序列 ,可编码 6 6 1个氨基酸残基组成的多肽 ,预计分子量为 76 .5kD。将所推导的HaSNPVIE 1氨基酸序列与其它已知的杆状病毒IE 1氨基酸序列进行比较 ,结果表明 ,HaSNPV和谷实夜蛾H .zea单粒包埋型核型多角体病毒IE 1氨基酸序列最为相似 ,同源性高达 98%。与AcMNPV、家蚕Bombyxmori核型多角体病毒 (BmNPV)、云杉卷叶蛾Choristoneurafu miferana多粒包埋型核型多角体病毒 (CfMNPV)、舞毒蛾Lymantriadispar多粒包埋型核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾Orgyiapseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒 (OpMNPV)、甜菜夜蛾Spodopteraex igua多粒包埋型核型多角体病毒 (SeMNPV)、小菜蛾Plutellaxylostella颗粒体病毒 (PxGV)和Xestiac ni grum颗粒体病毒 (XcGV)的IE 1氨基酸序列同源性较低 ,分别为 2 3 %、2 3 %、2 3 %、2 5 %、2 3 %、1 4%、2 7%和 7%。根据氨基酸序列由GENETYX     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析

【目的】研究斜纹夜蛾核型多角体病毒II ORF146基因的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV IIORF146基因序列设计引物,经PCR扩增克隆ORF146基因。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF146片段的原核表达载体,表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明,读码框含1383 bp,编码460个氨基酸的蛋白质,推定分子量为50.4 kDa。启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早、晚期都表达的基因,在病毒感染8 h和18 h有两个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但趋于稳定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高,效价可达1∶3200以上。【结论】SpltMNPV II ORF146基因是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。推测ORF146基因可能与SpltMNPV II病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关。制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。     

新城疫病毒非编码序列的遗传演化趋势

【目的】探讨新城疫病毒全基因序列中非编码序列的分子演化规律。【方法】结合本研究室2012年自产蛋下降鸭群中分离测序的一株鸭源新城疫病毒全序列,从GenBank下载35株不同基因型新城疫病毒全长cDNA序列,获取非编码序列,分别绘制引导序列、尾随序列、F-HN及HN-L基因间隔序列(IGS)的遗传进化树,比较编码基因内5’及3’UTR序列核苷酸序列替代特点。【结果】非编码序列的长度及位置高度保守,而其核苷酸基因序列在不断发生变异,且变异趋势与编码基因序列相一致。【结论】新城疫病毒在整个基因组上编码和非编码序列同步发生变异。     

鸽新城疫病毒BJ-C分离株基因组测序及系统发育分析

【背景】鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-1)感染引起的危害最严重的疫病之一,至今尚无有效的防控制剂。【目的】分析鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组信息及系统发育关系,为鸽新城疫的防控提供科学依据。【方法】设计首尾重叠的6对特异性引物,利用分段扩增的方法,以鸽新城疫病毒BJ-C株基因组cDNA为模板,分别扩增、测序后进行全基因组序列拼接。以NCBI数据库中发布的新城疫病毒序列为参考,针对鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组、F基因建立系统发育树。【结果】鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组全长为15192nt。基于全基因组的系统发育分析发现其与PPMV-1/BJ-01/CH株的系统发育关系最近,核苷酸相似性为99.96%,氨基酸相似性高达100%,属于同一个分支,而与LaSota疫苗株等其他新城疫毒株的亲缘关系相对较远。基于F基因序列的系统发育树分析发现BJ-C株F基因与我国的BJP2013株同属一个分支。ClassⅡ类Ⅵ亚型F基因高变区序列(47-420nt)比对结果显示,安徽株Pigeon/Anhui/2369/2012、广东株Pigeon/Guangdong/GZ288/2013、北京株BJP13、浙江株Pigeon/Zhejiang/2036/2012及比利时株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011等与BJ-C毒株处于同一个分支,同属Ⅵb亚型。【结论】本研究获得了鸽新城疫病毒BJ-C株全基因组序列,分析了其系统发育关系,确定其属于ClassⅡ类Ⅵb型,为后续防控产品的开发提供了理论依据。     

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodoptera litura培养细胞,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的3株斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)（K-3、G1-2和G10-3）进行了生物学活性和分子生物学的初步研究,克隆了多角体蛋白基因,并进行了序列分析和比较。结果表明:（1）SpltMNPV日本分离株K-3、G1-2和G10-3分别具有不同的特征性酶切图谱,分别属于3种基因型（A型、B型和C型）; （2）3个分离株的芽生型病毒（budded virus）产生能力和多角体产生能力有差异,免疫印迹分析表明,多角体蛋白的分子量也不同;（3）日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由747个核苷酸编码序列（编码249个氨基酸）组成,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为98.9%,与其他6种核型多角体病毒有较高的同源性（61.7%～74.2%）,但其5′端侧翼序列(nt-1～-100)与AcMNPV和BmNPV相比差异显著,在对该基因表达调控起决定性作用的8个高度保守核苷酸序列中（nt-44～-51）有2处发生自然突变。     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

Nucleotide sequence and molecular characterization of the structural glycoprotein gp41 gene homologue of Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus (spltNPV-I)

The structural glycoprotein gene gp41 homologue of Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus (SpltNPV-I *) was identified in the 4.0 kb EcoRI-L fragment of the viral genome. The nucleotide sequence of 2063 bp of this fragment revealed an open reading frame of 1014 nucleotides to encode a polypeptide of 337 amino acids. Analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences of the putative ORF indicated its identity with gp41 protein of other baculoviruses sharing maximum homology with that of Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrosis virus (SfNPV). The coding sequence was preceded by an AT-rich region containing the consensus baculoviral late promoter motif RTAAG. The putative SpltNPV gp41 ORF was abundantly expressed as a 37 kDa apoprotein in E. coli and as a 50 kDa glycoprotein in Sf9 cells. The recombinant protein expressed in insect cells was glycosylated (20%) and has GlcNAc as the terminal sugar. The gene is conserved among baculoviruses and places SpltNPV-I close to Spodoptera frugiperda and Spodoptera exigua NPVs in phylogenetic tree.     

斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltNPV）基因组EcoRI—G片段的序列分析

斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltNPV)基因组EcoRI G片段全长 745 0bp ,包括 7个开放读码框 :vp39、lef 4、cg30、p91、vp33、tlp2 0、AcMNPVORF81同源基因和一个同源区 (hr)。基因组排列比较分析发现 ,这些基因在基因组中的排列 ,在所有已知序列的杆状病毒中都比较保守     

银染色测定粘虫核多角体病毒多角体基因序列

LsMNPV DNA用EcoRV酶切进行基因组克降,用AcMNPV的部分多角体基因顺序DNA片段作探针,菌落原位杂交法结合测序筛选到分别含LsMNPV部分多角体基因的重组质粒pLsEV1和pLsPH5。用银染色PCR线性扩增双脱氧法测序,发现LsMNPv的完整基因即位于这两个片段上。LsMNPV多角体基因长741bp,编码区碱基同源性与AcMNPV和MbMNPV分别为80.0％和97.0％,氨基酸同源性分别为89.8和97.5％。氨基酸组成中以谷氨酸(Glu)含量最高,谷氨酰胺和色氨酸含量最低。密码子选用以第三个碱基为嘧啶的密码子频率最高。多角体蛋白N端有一类似信号肽结构的26个氨基酸的疏水区。     

Identification and expression of a conserved ubiquitin gene homologue of Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus (spltNPV-I)

An ORF having a potential to code for a polypeptide of 79 amino acids has been identified within 993 nt sequence of 2 kb EcoRI-W fragment of Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus (SpltNPV-I). Nucleotide and deduced amino acid sequence analyses showed its identity with the ubiquitin homologue of eukaryotes (79-80%), Melanoplus sanguinipes entomopoxvirus (76%) and other baculoviruses (72-89%). The ORF is under baculovirus late promoter motif RTAAG but unlike other baculoviruses, three such motifs at -6, -10 and -27 position are present in SpltNPV. The ORF expresses as a 10 kDa proteinin E. coli and the purified recombinant protein showed crossreactivity with the rabbit anti-ubiquitin antibodies.     

中华蜜蜂囊状幼虫病毒北京分离株VP1蛋白基因序列特征及原核表达

【目的】研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus, CSBV）VP1蛋白的分子进化特征及遗传多样性。【方法】利用RT-PCR方法,克隆了8株CSBV北京分离株VP1蛋白的基因编码区。【结果】序列分析表明,VP1蛋白基因编码区开放阅读框长945 bp,编码315个氨基酸,推测编码蛋白的相对分子量和等电点分别为35.42 kDa和9.23,具有亲水性和免疫原性。序列同源性分析表明,不同年份CSBV北京分离株VP1蛋白氨基酸序列间差异较小,仅个别氨基酸存在差异。北京分离株与辽宁分离株及越南分离株VP1核苷酸序列一致性达93%,与印度及韩国分离株VP1核苷酸序列一致性达92%,与英国分离株VP1核苷酸序列一致性最低,为88%。序列分析同时表明,CSBV北京分离株VP1蛋白序列存在特有的序列特征,同其他地区分离株比较,北京分离株VP1蛋白序列中存在着氨基酸的插入突变。序列替换率分析表明,亚洲型分离株间序列替换率低于亚洲分离株与欧洲分离株间的替换率。构建原核表达载体pEASY-E1-VP1,经IPTG诱导,CSBV VP1蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pLysS菌株中表达。【结论】本研究提示CSBV不同分离株基因序列存在变异,结果为进一步研究CSBV致病性分化的分子机理奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的鉴定及表达分析

【目的】本研究旨在探讨蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的表达规律,为害虫防治提供潜在的作用靶标。【方法】以家蚕Bombyx mori CYP450基因为查询序列,通过同源比对的方法从斜纹夜蛾Spodoptera litura基因组中鉴定蜕皮激素合成代谢通路中的CYP450基因,并构建其系统进化树;采用qPCR法检测鉴定的CYP450基因在斜纹夜蛾不同发育阶段(6龄幼虫、预蛹和蛹)、这3个发育阶段的不同组织(中肠、表皮和脂肪体)以及4龄幼虫取食不同寄主植物(辣椒Capsicum annuum、黄瓜Cucumis sativus、番薯Ipomoea batatas和花生Arachis hypogaea)叶片后5龄幼虫中肠中的表达量,计算4龄幼虫取食不同寄主植物叶片后发育至蛹的历期;应用PITA, miRanda, microTar和RNAhybrid 4种软件,预测调控鉴定的CYP450基因的微小RNA (miRNA)。【结果】鉴定到斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关的6个直系同源CYP450基因CYP307A1, CYP306A1, CYP302A1, CYP315A1, CYP314A1和CYP18A1;系统进化树显示,斜纹夜蛾这6个CYP450基因分别归属于CYP2和线粒体CYP两个亚家族。CYP306A1, CYP314A1和CYP18A1分别在6龄幼虫、预蛹和蛹期具有最高的表达量,并且分别在6龄幼虫中肠、预蛹脂肪体和蛹表皮中表达量最高。相比取食人工饲料的对照组,4龄幼虫取食番薯和花生叶片后斜纹夜蛾4龄幼虫发育至蛹的历期显著延长, CYP306A1在5龄幼虫中肠中的表达量显著上调。在CYP307A1,CYP315A1, CYP314A1和CYP18A1上鉴定出了多种miRNA结合位点。【结论】蜕皮激素合成代谢通路中,CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1可能分别在斜纹夜蛾幼虫、预蛹和蛹期起着关键的调控作用,同时也参与宿主植物次生代谢产物的解毒代谢,并且受到miRNA的严密调控。研究结果不仅有助于深入理解昆虫变态发育调控的复杂机制,还为将来的害虫防治提供了潜在的作用靶标,有利于斜纹夜蛾等害虫的可持续治理。     

SpltMNPV日本分离株gp41的克隆表达及gp41和ph的进化分析

从斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)日本分离株(C3)基因组中克隆了gp41基因。该基因编码区含993bp核苷酸,编码分子量为36.9kDa的多肽。将该基因克隆至原核表达载体pET28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达。应用CLUSTAL程序分析表明,SpltMNPV日本株(C3)gp41的核苷酸序列和氨基酸序列与SpltMNPV中国G2株相似性最高,均达99.9%。用MEGA分别构建了基于gp41和ph的聚类分析图和分子进化树,发现它们具有相似的拓扑结构。将这两个基因序列结合在一起构建进化树,该树的结构与基于gp41的进化树相似。突变率分析显示gp41的突变率高于ph,这意味着在杆状病毒进化过程中,gp41和ph面临不同的选择压力。