一种直接用于蛋白质测序的快速电印渍技术

蛋白质印渍是指在一定的驱动力作用下将蛋白从凝胶上转移至某种印渍膜上的方法,有扩散印渍、真空印渍和电印渍三种。其中电印渍应用最为广泛,在理想条件下可将90％以上的蛋白质转移至印渍膜上。印渍膜有多种多样,如硝酸纤维素膜、阳离子化尼龙膜、DBM（diazo－benzy－loxymethy）、DPT（diazo－phenylthioether）、SGF（siliconnedglassfiber）和PVDF（polyvinylidenedifluoride）膜等“‘。近年来,又在此基础上发展了一种微量蛋白质N一端序列分析技术［’j。如果把蛋白质数据库资料与计算机结合起来,人们就有可能根据N一端序列…     

一种简便快速的蛋白质免疫印渍法介绍

一种简便快速的蛋白质免疫印渍法介绍骆爱玲,王继伟,李佳格（中国科学院植物研究所,北京１０００４４）ＡＳＩＭＰＬＥＭＥＴＨＯＤＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＢＬＯＴＴＩＮＧＡＮＤＬＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＬｕｏＡｉ－ｌｉｎｇ;ＷａｎｇＪｉ－ｗｅｉ;Ｌｉｊｉａ－ｇｅ（...     

测定a-淀粉酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法

建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法。此法的实验条件容易控制,重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到α-淀粉酶活性。     

测定α-淀粉酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法

建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法.此法的实验条件容易控制,重复性好.组织印渍法在玉米种子吸水约5 h后即可检测到α-淀粉酶活性.     

镰孢体外抗原的电泳及免疫印渍分析

用SDS-PAGE及免疫印渍法分析了三种镰孢的体外抗原(exoantigen)和菌丝体可溶性蛋白质的部分特性,并研究了培养基对体外蛋白质含量的影响。结果表明,在电泳分析中,三种镰孢体外抗原及菌丝体可溶性蛋白质均具有各自菌种的特征,可作为菌种分类鉴定的重要指标。免疫印渍分析显示,体外抗原更适于用作免疫分类鉴定的指标,因为用体外抗原免疫动物所产生的抗体的特异性比菌丝体可溶性蛋白质要好。三种镰孢的体外抗原的抗体与种间菌株均有程度不等的交叉反应,但却不与谷物发生任何交叉反应,可用于谷物中镰孢的快速检测。在镰孢体外抗原中,能刺激机体产生抗体的抗原分子量在28000以上。葡萄糖酵母膏培养基比蔗糖硫酸铵培养基更适于体外抗原的产生。     

氮肥和6-BA对花后受渍冬小麦抗渍性的调控效应

渍水是黄淮南部麦区和长江中下游麦区冬小麦生育后期的主要气象灾害因子,试验以小麦品种‘烟农19’为材料,采用裂区设计研究氮肥和6-BA对花后受渍冬小麦抗渍性的调控效应。结果显示:(1)花后渍害显著降低冬小麦根系活力、总吸收面积、活跃吸收面积、旗叶叶绿素含量、旗叶净光合速率,极显著降低穗粒数、千粒重和籽粒产量,而对穗数无显著影响。(2)受渍后叶面喷施氮肥+6-BA、氮肥、6-BA均能显著提高冬小麦花后抗渍性,其根系活力分别提高18.7%、14.6%、12.0%,根系总吸收面积分别提高31.9%、22.1%、19.6%,根系活跃吸收面积分别提高32.5%、21.7%、18.1%,叶绿素含量分别提高16.2%、9.4%、10.3%,净光合速率分别提高32.6%、23.3%、23.3%,穗粒数分别提高13.8%、9.3%、8.5%,千粒重分别提高17.3%、11.5%、10.5%,籽粒产量分别提高35.9%、23.5%、20.9%。研究表明,氮肥和6-BA正交互作用显著,即花后同时喷施氮肥和6-BA缓解小麦渍害的效果更佳。     

高效毛细管电泳在蛋白质分析上的应用

高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）是继高效液相色谱技术之后的又一新型分析及分离技术,本文应用高效毛细管电泳技术对基因工程干扰素、疫苗、动物脏器提取物等蛋白质产品进行了分离分析和纯度鉴定,并与凝胶电泳的分析结果进行对比。实验结果表明,ＨＰＣＥ可以用于生物产品分离、生物遗传研究和医学临床等领域的蛋白质定量分析、组分测定和纯度鉴定,是一种很有应用前途的新技术。     

基因工程产品的N末端均一性及其中残留的痕量杂质蛋白的分析

利用Edman降解法,辅之以邻苯二甲醛阻断等技术,在蛋白／多肽测序仪－PTH氨基酸分析仪上微量自动测定了在大肠杆菌系统获得高效表达的重组人γ干扰索、α 2干扰素和白细胞介素－2等多种基因工程产品的N末端氨基酸序列。根据氨基酸色谱分析的原始资料,对上述蛋白质样品的N末端均一性进行了细致分析。在此基础上,借助序列库检索比较等计算机方法检定了这些样品中可能残留的痕量杂质蛋白,并对分析痕量残留蛋白的一般方法进行了讨论。分析结果表明重组人丫干扰素N束端均一;而a 2干扰素和白细胞介素一2的N末端不均一,其中主要含大致等量的N末端带有蛋氨酸与不带蛋氯酸的两种分子,仅在个别送检样品中发现痕量N末端丢失一个氨基酸的分子。通过在序列库中检索所测出的一段八肽疑似序列,推断在一批送检样品中含有痕量的卵清溶菌酶,经进一步纯化样品并测序后得以证实。本文结果为进一步优化和确定有关产品的生产流程并建立产品质量控制的标准提供了重要依据。     

电泳滴定曲线及其应用

电泳滴定曲线法是一种双向电泳法,第一向等电聚焦,以获得固定的pH梯度;然后加样,进行第二向电泳,得到的电泳滴定曲线图,直接反映了在各种pH下,各蛋白质组分之间在迁移率上的差异。该法在选择蛋白质分离纯化的最佳条件;研究蛋白质的突变;研究分子间相互作用等领域,已表现出广阔的应用前景。     

涝渍胁迫对喜树幼苗形态和生理的影响

为了解喜树对涝渍土壤条件的适应性, 通过温室土培盆栽试验, 从形态和生理两方面探讨了涝渍胁迫对1年生喜树(Camptotheca acuminata)实生苗的影响, 试验分对照、轻度渍水、渍水和淹水等4个处理, 处理时间为 21 d。结果表明, 喜树根系生长以轻度渍水最好, 其次为对照, 而渍水和淹水的处理初生根系逐渐腐烂、死亡, 与之相对应, 轻度渍水处理的根系活力与对照无显著差异, 但渍水和淹水处理随着处理时间的延长逐渐下降, 同时观察到渍水和淹水的喜树茎在水面以下部位出现较多的皮孔。随着处理时间的延长, 轻度渍水处理喜树叶片内POD和SOD活性一直保持较高水平, 渍水和淹水处理则表现出先升高后下降的趋势, 各个处理叶片中O₂^-· 、H₂O₂和MDA含量有逐渐升高的趋势, 且各处理之间均表现为淹水>渍水>轻度淹水>对照。各处理根系LDH活性在处理前期较对照低, 而在处理的中后期, LDH活性均比对照高, 以渍水和淹水处理最高。因此, 喜树在轻度渍水条件下, 一方面由于皮孔和不定根的增多, 根系能够获得更多的氧气, 另一方面由于POD和SOD抗氧化酶活性的增强, 降低了O₂^-·和H₂O₂对细胞的伤害, 喜树能够在轻度渍水的立地上正常生长。     

Western印迹中蛋白质定量分析的替代方法

Western印迹广泛采用显像密度计法对特异性蛋白质表达进行定量,但是仍然存在敏感性的问题尚未解决。同时,昂贵的试剂与复杂的设备限制了其应用。建立了一种改良定量检测法,使用碱性磷酸酶标记的第二抗体,以萘酚磷酸盐和快红作反应底物。吸附膜上的终末显色用有机溶剂洗脱,通过测定光吸收值定量。结果显示该法更简便、快速、经济而不失其敏感性。     

电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响.采用抗凋亡抑制蛋白-Survivin的抗体,对细胞裂解液进行蛋白质印迹.与常规操作方法不同之处是：在电转移的凝胶“三明治”中,重叠放置两张硝酸纤维素膜.电转移后,对两张膜同时进行免疫印迹.在特定的转移条件下,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象.转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量,都是影响蛋白质透膜的相关因素.电转移中蛋白质的透膜,可以产生“印迹复制失真”的效应,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果.所得实验结果和结论,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题,对于科学掌握和应用该技术具有积极作用.     

转移缓冲液对蛋白质印迹的影响

利用三种转移缓冲液,分别以半干和湿转法,检测癌基因产物Bcl-2, 并获得不同强度的印迹结果.不含SDS的转移缓冲液转移效果明显优于含SDS的转移缓冲液,且SDS含量越高印迹带越弱;此外,半干转移与湿转相比,可大大缩短转移时间,但转移效果不及湿转理想且稳定性较差.     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques

Introduction: Western blotting is one of the most commonly used techniques in molecular biology and proteomics. Since western blotting is a multistep protocol, variations and errors can occur at any step reducing the reliability and reproducibility of this technique. Recent reports suggest that a few key steps, such as the sample preparation method, the amount and source of primary antibody used, as well as the normalization method utilized, are critical for reproducible western blot results.

Areas covered: In this review, improvements in different areas of western blotting, including protein transfer and antibody validation, are summarized. The review discusses the most advanced western blotting techniques available and highlights the relationship between next generation western blotting techniques and its clinical relevance.

Expert commentary: Over the last decade significant improvements have been made in creating more sensitive, automated, and advanced techniques by optimizing various aspects of the western blot protocol. New methods such as single cell-resolution western blot, capillary electrophoresis, DigiWest, automated microfluid western blotting and microchip electrophoresis have all been developed to reduce potential problems associated with the western blotting technique. Innovative developments in instrumentation and increased sensitivity for western blots offer novel possibilities for increasing the clinical implications of western blot.     

新城疫病毒融合蛋白基因部分序列分析

Ｆ蛋白是ＮＤＶ中具有抗原性的两种表面糖蛋白之一,通过ＲＴ－ＰＣＲ,克隆了速发现ＮＤＶ中国株Ｆ４８Ｅ８的Ｆ基因,比较分析Ｆ４８Ｅ８,ＡＵＳ和ＩＴＡ等速发型株系Ｆ基因的Ｎ端结构,氨基酸同源性分别达９５％和９３．６％,变化主要集中于信号肽区,成熟蛋白质的同源性极高。该基因的克隆为研制ＮＤＶ的基因工程疫苗打下基础。     

玉米核糖体失活蛋白基因的克隆及序列分析

将提取的玉米RNA反转录成Cdna,以此为模板,合成特异性引物,应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增出目的片段。对PCR片段直接进行序列分析,测定并克隆玉米的核糖体失活蛋白(RIP)基因。序列分析表明,已测定的玉米RIP基因序列长为983bp,其中编码区长828bp,共编码有275个氨基酸和一个终止密码子,GC含量为58.3%。与已发表的序列相比较其核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为98.4%和97.4%。