丹参bHLH转录因子基因SmMYC2的克隆和表达分析

MYC2是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子,在植物防御反应、次生代谢调控及生长发育过程中均有重要的调控作用。基于丹参转录组和基因组survey序列,本研究克隆了丹参转录因子MYC2的基因序列,并命名为Sm MYC2(Gen Bank No.KJ945636)。Sm MYC2基因的c DNA序列长度为1910 bp,开放阅读框(ORF)的长度为1809 bp,编码602个氨基酸,无内含子;该基因编码蛋白与烟草、番茄等植物的MYC2蛋白具有较高的同源性;Sm MYC2蛋白无跨膜结构域、信号肽等结构。实时荧光定量PCR检测结果显示,Sm MYC2在丹参的根、茎、叶、花中均有表达,并且在根和茎中的表达量更高;此外,该基因表达受茉莉酸甲酯、光和机械损伤的诱导,但受赤霉素的抑制。本实验结果为进一步探讨Sm MYC2基因在丹参中的生物学功能奠定了基础。     

苦荞转录因子基因FtbHLH4的克隆及其对非生物胁迫的应答

根据苦荞花期转录组数据,克隆得到1个苦荞bHLH类转录因子基因,命名为FtbHLH4。采用实时荧光定量PCR技术,分析了非生物胁迫对苦荞芽期FtbHLH4基因表达的影响。序列分析表明,苦荞FtbHLH4基因DNA全长1 852bp,由7个外显子和6个内含子构成,符合GT-AG剪接原则;cDNA序列包含1个1 062bp的开放阅读框,编码353个氨基酸,具有bHLH类蛋白典型的螺旋-环-螺旋保守结构域。在脱落酸(ABA)、NaCl和PEG模拟干旱胁迫下,苦荞芽期FtbHLH4基因表达量均持续上升,至48h时达最大,分别为胁迫前的11.3倍、12.0倍和6.1倍。而在冷胁迫和UV-B胁迫下,苦荞芽期FtbHLH4基因表达量迅速下降,分别于6h和12h降低至胁迫前的24%和23%。研究推测FtbHLH4基因以不同机制参与了苦荞对非生物胁迫的应答过程。     

bHLH转录因子家族研究进展

bHLH转录因子在真核生物生长发育调控中具有重要作用, 它们组成了转录因子的一个大家族。已经有20种生物基因组中bHLH家族的成员得到鉴定, 其中动物17种、植物2种、酵母1种。动物bHLH因其调控基因表达的功能不同而被分成45个家族; 此外, 根据它们所作用DNA元件和自身结构特点又被分成6个组。A组包含22个家族, 主要调控神经细胞生成、肌细胞生成和中胚层形成; B组包含12个家族, 主要调控细胞增殖与分化、固醇代谢与脂肪细胞形成以及葡萄糖响应基因的表达; C组包含7个家族, 主要负责调控中线与气管发育和昼夜节律、激活环境毒素响应基因的转录; D组只有1个家族, 它与A组bHLH蛋白形成无活性的异源二聚体; E组有2个家族, 调控胚胎分节、体节形成与器官发生等; F组也只有1个家族, 调控头部发育、嗅觉神经元生成等。文章综述了bHLH转录因子家族分类、起源、功能方面的研究进展情况。     

转录因子AP-4基因真核表达载体构建及表达分析

本研究利用生物信息学分析AP-4与胃癌患者临床病理信息的相关性,根据GenBank中人AP-4基因cDNA序列设计并合成特异性引物,以胃癌细胞总RNA逆转录的cDNA为模板,利用高保真酶扩增AP-4基因CDS (Coding DNA sequence)序列并构建入pcDNA3.1+载体,并通过限制性内切酶酶切分析和测序法进行进一步验证;脂质体法将AP-4重组表达载体及对照pcDNA3.1+载体转染胃癌细胞,qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)和Western blotting检测分别检测AP-4在m RNA和蛋白水平的表达。生物信息学分析发现,AP-4的表达与胃癌分期及预后显著相关;酶切及测序分析表明,转录因子AP-4真核表达载体构建成功,并能够在胃癌细胞中实现转录和蛋白水平的高效表达。此研究为深入研究转录因子AP-4在胃癌等肿瘤发生发展中的作用及分子机制奠定了基础。     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

曲霉属bHLH转录因子的研究进展

bHLH(Basichelix-loop-helix)转录因子广泛存在于真核生物中,它可以通过同源或异源二聚体的形式与基因启动子上的E-box结合来调控基因的表达。转录因子的bHLH家族由广泛涉及发育过程(包括细胞增殖和分化)的大量蛋白组成,在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用。本文对包括构巢曲霉、烟曲霉、米曲霉等曲霉属中现已发现bHLH转录因子的调控过程和生物功能进行概述,以期为深入研究曲霉属的生长发育及bHLH转录因子的功能提供理论参考。     

转录因子Atonal家族的研究进展

转录因子atonal因其具有一个碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结构而被归属于bHLH转录因子家族,在调节真核生物生长发育过程中起着重要作用.目前的实验研究已经证明它与视觉、听觉、嗅觉的形成有关,同时在不同时期还能够决定细胞的分化命运和抑制肿瘤的扩散.主要从模式生物果蝇和小鼠中的基因结构、组织分布、功能特征等方面研究概述,为进一步了解其他物种atonal转录因子的功能和作用机制奠定基础.     

植物bHLH转录因子的结构特点及其生物学功能

bHLH(basic/helix-loop-helix)转录因子在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用,它们组成了转录因子中的一个大家族。bHLH转录因子不仅普遍参与了植物的生长发育,包括毛状体的发生、光形态建成和光信号转导,而且在植物响应逆境胁迫和次生代谢方面也具有重要作用。对植物bHLH转录因子的结构特点及其生物学功能进行综述。     

云南红皮梨bHLH转录因子的生物信息学分析

具有碱性-螺旋-转角-螺旋结构的一大类基因被称为bHLH家族基因,其成员主要有c-MY C、MA DL、MA X、MIX L和MNT基因;bHLH转录因子在细胞的增殖、分化和凋亡方面起着重要作用;对植物的生长发育、营养吸收、生物合成和信号转导等方面同样有着重要作用。在果肉、叶片和外果皮中,CsMY C2的表达与CHS、UFGT及A NS表达相关联,因此CsMY C2参与花色苷的生物合成调控,但是该基因在云南红皮梨花色苷合成调控中起着什么样的作用尚不清楚。利用生物信息学方法对云南红皮梨(Red Pyrus pyrifolia) bHLH基因进行分析,对不同植物间bHLH基因氨基酸序列的同源性比对,并且对该基因编码的蛋白质的理化性质、结构和功能等进行预测和分析。结果表明：该蛋白属于亲水性蛋白,其二级结构中的主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,并散布于整个蛋白。这一结果为研究红皮梨bHLH基因的结构、功能以及红皮梨的着色机制奠定了一定的基础。     

番茄LeDREB1转录因子基因RNAi载体的构建和鉴定

利用rd29A基因启动子的DRE元件从番茄(丽春)cDNA文库中通过酵母单杂交技术筛选得到转录因子基因LeDREB1。核苷酸序列测定结果表明,该基因片段全长1 782 bp,具有900 bp的cDNA开放阅读框序列,编码300个氨基酸。该基因属于AP2/EREBP家族[1],可能调控许多逆境应答基因的表达。运用RNA干扰的思路,设计特异性引物,扩增正向和反向基因片段。将LeDREB1正向+反向基因片段插入到pCAMBIA2300-OCS的35s启动子下游,构建干扰载体pCAM-RNAi-LeDREB1,通过酶切和测序鉴定证明目的片段与载体片段连接正确。这一载体的成功构建为进一步研究LeDREB1的功能和调控作用机制提供有效的材料与技术支撑。     

丹参肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与生物信息学分析

分析丹参转录组数据库,获得一条新的肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因,命名为SmCCR-2(GenBank注册号为JF784010)。该基因包含一个长为966 bp的完整开放读码框,编码321个氨基酸残基。生物信息学分析显示,SmCCR-2编码的蛋白具有NWYCY基序,属于NABD_Rossmann超家族,相对分子量为35.80 kD;预测SmCCR-2为中性亲水的稳定蛋白,存在跨膜结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmCCR-2基因在丹参各组织都有表达,茎中表达量最高。其表达受到病原菌的影响,表明SmCCR-2基因可能与植物防御反应有关。     

丹参胁迫诱导基因SmSIP1的表达特征分析

从丹参EST库中筛选到一个胁迫诱导蛋白基因,命名为SmS1P1,其序列全长296bp,编码80个氨基酸。生物信息学预测表明SmS1P1是一个亲水的,不具有跨膜结构域,包含一个N-端信号肽和多个可能的磷酸化位点的蛋白。实时荧光定量PCR分析显示,SmS1P1在根中的表达量高于茎和叶,并且受ABA和干旱的诱导,推测其可能参与根部的胁迫应答反应。     

丹参肉桂醇脱氢酶基因（SmCAD）的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD（Genebank注册号：HQ162287）。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP（H）结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。     

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。     

丹参miR408基因前体序列的克隆及表达分析

MiR408是植物中一类高度保守的miRNA,其靶基因编码含铜蛋白,miR408的表达受植物生长发育和环境条件的显著影响。拟南芥中miR408在HY5-SPL7基因网络中起着关键作用,而HY5-SPL7基因网络可介导拟南芥对光照和铜离子的协调应答,进一步表明miR408在植物对环境的响应中发挥了核心作用。本研究基于丹参基因组Survey数据库,从中搜索并克隆得到366 bp的含有稳定茎环结构的miR408前体序列及其上游723 bp片段的启动子区,Gen Bank登录号分别为KU360384和KU360385,并将miR408的前体序列命名为SmMIR408。生物信息学分析结果显示:Sm-MIR408上游启动子序列与模式植物拟南芥Ath-MIR408、水稻OsaMIR408启动子区具有许多相同的顺式作用元件,如G-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、GTAC-motif等,而HSE、CATT-motif作用元件仅存在于丹参启动子区;miR408成熟序列在不同物种中具有很高的保守性;基于不同物种miR408前体序列构建的系统进化树显示,来源于单子叶植物的miR408前体序列聚为一支,来源于双子叶植物的miR408前体序列聚为另一支。实时定量PCR分析结果显示:Sm-MIR408在丹参的根、茎、叶、花中都有表达,其在花中的表达量最高,根中最低;Sm-MIR408的表达受茉莉酸甲酯和伤害的抑制,黑暗和持续光照也可抑制该基因的表达。Sm-MIR408基因的克隆与表达分析为今后研究丹参miR408的功能奠定了基础。     

转TaLEA1基因丹参植株的耐盐与耐旱性

TaLEA1基因是一个从小麦中克隆得到的编码胚胎晚期丰富蛋白的基因,用农杆菌EHA105（含卡那霉素抗性基因表达载体PBI121-TaLEA1）介导的叶盘转化法将其转入丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）组织培养苗中,在50mg/L卡那霉素选择压下连续筛选,并扩繁和生根培养,获得了7个丹参转基因株系。经PCR扩增,初步验证得到6个阳性株系,再继代4次后,Southern杂交结果表明已获得了一个能稳定遗传的转基因株系。该株系在含1%NaCl和8%PEG6000培养基中的生长状态优于野生型,表明转入TaLEA1基因可改善丹参组培苗的耐盐和耐旱性。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。