CTAB法提取野野村菌基因组DNA

针对用常规方法难以提取野野村菌基因组DNA的问题,通过选用添加甘氨酸的不同培养基和不同培养时间获得的菌丝体,采用液氮研磨结合CTAB法提取野野村菌DNA,电泳检测及计算OD260/OD280值。结果表明,在添加0.3%甘氨酸的麦芽汁-酵母膏(YE)培养基中振荡培养培养3d的菌丝体适合于DNA提取,用CTAB法获得的基因组DNA,长度约为20kb,且OD260/OD280在1.8左右,达到基因组DNA-DNA杂交的要求。     

小麦网腥黑粉菌冬孢子总DNA提取方法比较

目的：研究提取不同时期小麦网腥黑粉菌冬孢子总DNA的最佳方法。方法：应用改良过的四种方法（CTAB法、SDS-CTAB法、SDS法和尿素法）对小麦网腥黑粉菌冬孢子总DNA进行提取。结果：提取当年小麦网腥黑粉菌冬孢子DNA,纯度（OD260/OD280）：CTAB法〉SDS-CTAB法〉SDS法〉尿素法=1.876〉1.7815〉1.7789〉1.6095;产率（μg/g）：SDS-CTAB法〉SDS法〉尿素法〉CTAB法=796.25〉664〉306〉291.5。提取15年的小麦网腥黑粉菌冬孢子DNA,纯度（OD260/OD280）：CTAB法〉SDS-CTAB法〉SDS法〉尿素法=1.91795〉1.8876〉1.65985〉1.55925;产率（μg/g）：尿素法〉CTAB法〉SDS法〉SDS-CTAB法=1529.25〉799〉687.25〉372.5。结论：SDS-CTAB法是提取当年小麦网腥黑粉菌冬孢子DNA的最佳方法。CTAB法是提取15年的小麦网腥黑粉菌冬孢子DNA的最佳方法。     

煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较

目的：在生物浸出中,微生物群落结构分析有着重要意义,而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA。为了解决这一问题,本实验通过比较两种较常用的DNA提取方法,煮沸裂解法和试剂盒法,寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA的方法。方法：分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA,从所提取的基因组DNA浓度、纯度、回收率和对PCR扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果;用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌,通过实时定量PCR来比较两种方法的灵敏性。结果：相同处理量（108个）的革兰氏阳性菌（1株）、革兰氏阴性菌（4株）、古菌（1株）经两种方法提取的基因组DNA差异较大,煮沸裂解法所得的6组基因组DNA更纯,其OD260／OD280的值更接近1．8-2．0（纯DNA的OD260／OD280在1．8—2．0之间）,前者所提DNA回收率最大可达后者的16．7倍;煮沸裂解法只需较少菌（102个）便能让实时定量PCR检测到所提DNA模板浓度,比试剂盒法灵敏。结论：两种方法提取的基因组DNA均可用于后续的PCR扩增,此外,前者提取的DNA浓度随细菌浓度增加而呈线性增大,而后者随茵浓度增大,所提DNA量增加有限,因此,在生物浸出中微生物基因组DNA的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法,为实验节约成本和时间。     

利用CTAB法和子囊孢子破壁法提取冬虫夏草菌DNA

通过CTAB法从冬虫夏草菌株和天然冬虫夏草不同部位提取DNA,并用PCR扩增进行验证,证明了CTAB法适合从冬虫夏草子座、菌核和冬虫夏草菌培养物中提取DNA。首次报道1种将子囊孢子破壁直接进行PCR扩增的方法,并比较了该方法和CTAB法在提取冬虫夏草DNA方面的差异。2种方法获得的DNA用于PCR扩增均能得到较好的结果。     

碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证

目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础.方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定.结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有Rnase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符.结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求.     

线粒体DNA提取方法的比较

目的：将提取线粒体DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA的方法。方法：分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase 8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果：改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260／OD280均在1．78-l.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于PCR扩增,测定出了线粒体DNA ATPase 8亚基基因序列。结论：改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。     

胡椒叶片基因组DNA提取方法比较

目的：研究建立胡椒叶片中提取高质量DNA的方法。方法：采用各种CTAB法和SDS法的改良方法,提取胡椒叶片中的总DNA,并对DNA进行紫外和电泳检测。结果：改良CTAB法4和5提取的DNA经电泳检测,有一条明亮主带,且无拖尾现象,样品槽无荧光出现,说明抽出的DNA纯度较高,一致性好;测定其OD260和OD280值,并计算其比值,OD260/OD280值在1.8-2.0之间,提取率在51.667-60.000μg/g之间,获得的基因组DNA质量高。结论：改良CTAB法4和法5可从胡椒幼叶中提取高质量DNA。     

孢子丝菌病快速诊断方法的探究

目的研究申克孢子丝菌DNA提取方法;探索申克孢子丝茵的种特异性引物,运用聚合酶链反应方法鉴定申克孢子丝菌;从而为临床孢子丝茵病的分子诊断奠定基础。方法用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌的基因组DNA;根据申克孢子丝茵钙调蛋白基因序列设计一对寡核苷酸引物,分别对52株申克孢子丝菌及3种6株普通真茵的基因组DNA进行PCR扩增。结果用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁成功提取出孢子丝菌的基因组DNA。特异性引物对52株申克孢子丝菌可扩增出一条约430 bp的片段,而对念珠菌、曲霉、黑霉基因组DNA扩增结果均为阴性。结论用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌基因组DNA与传统的CTAB法相比不仅操作更简便,而且避免了液氮研磨过程中难于避免的污染。运用我们所设计的特异性引物,结合PCR方法对申克孢子丝菌进行分子鉴定,结果显示不仅该引物对申克孢子丝菌特异、敏感而且该方法简便、快捷;可用于申克孢子丝菌病的临床诊断。     

香蕉枯萎菌基因组DNA提取方法的研究

以香蕉枯萎菌菌株为试验材料,在SDS～CTAB法和高盐沉淀法等基础上加以改进,对两种提纯香蕉枯萎菌基因组DNA的方法进行了比较研究。结果表明：高盐沉淀法是适合于香蕉枯萎菌基因组DNA提取的方法。该方法提取的DNA OD260／OD280的比值为1．841,DNA产量为0．81mgDNA／g菌丝体。基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳得到一条带型较宽且清晰的DNA谱带,基本无DNA碎带;将提取的DNA直接用于PCR扩增,得到带多而且清晰、整齐、基本无拖尾的RAPD图谱。     

煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较

目的:在生物浸出中,微生物群落结构分析有着重要意义,而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA。为了解决这一问题,本实验通过比较两种较常用的DNA提取方法,煮沸裂解法和试剂盒法,寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA的方法。方法:分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA,从所提取的基因组DNA浓度、纯度、回收率和对PCR扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果;用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌,通过实时定量PCR来比较两种方法的灵敏性。结果:相同处理量(108个)的革兰氏阳性菌(1株)、革兰氏阴性菌(4株)、古菌(1株)经两种方法提取的基因组DNA差异较大,煮沸裂解法所得的6组基因组DNA更纯,其OD260/OD280的值更接近1.8-2.0(纯DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之间),前者所提DNA回收率最大可达后者的16.7倍;煮沸裂解法只需较少菌(102个)便能让实时定量PCR检测到所提DNA模板浓度,比试剂盒法灵敏。结论:两种方法提取的基因组DNA均可用于后续的PCR扩增,此外,前者提取的DNA浓度随细菌浓度增加而呈线性增大,而后者随菌浓度增大,所提DNA量增加有限,因此,在生物浸出中微生物基因组DNA的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法,为实验节约成本和时间。     

小麦与蚕豆间作系统氮肥调控对小麦白粉病发生及氮素累积分配的影响

通过田间小区试验,设N₀(0 kg·hm^-2)、N₁(112.5 kg·hm^-2)、N₂( 225 kg·hm^-2)、N₃( 337.5 kg·hm^-2) 4个施氮水平,研究不同施氮水平下小麦与蚕豆间作对小麦白粉病发生、植株氮含量和氮素累积分配的影响,探讨间作系统氮肥调控下小麦植株氮素含量、氮素累积分配与白粉病发生的关系.结果表明: 无论单作还是间作,施氮(N₁、N₂和N₃)均增加了小麦籽粒产量,以N₂水平下产量最高,单、间作分别为4146和4679 kg·hm^-2;施氮加重了小麦白粉病的发生与危害,N₁、N₂和N₃水平下病害进展曲线下的面积(AUDPC)分别平均增加39.6%～55.6%(基于发病率DI)和92.5%～217.0%(基于病情指数DSI),病情指数受氮素调控的影响较发病率大;施氮显著提高小麦植株氮含量(8.4%～51.6%)和氮素累积量(19.7%～133.7%),对氮素分配比例无显著影响.与单作相比,间作小麦产量平均增加12.0%;AUDPC(DI)和AUDPC(DSI)分别平均降低11.5%和30.7%,间作对病情指数的控制效果优于发病率.间作显著降低发病盛期小麦氮含量、阶段累积量和叶片中氮素分配比例(降幅6.6%～12.5%、1.4%～6.9%和9.0%～15.5%).在本研究条件下,兼顾控病效果和产量效应,小麦施氮量不应超过225 kg·hm^-2.     

T淋巴细胞亚群CD4+比例标准物质的研制

CD4⁺ T细胞的减少常见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病等。检测实验室常需要对CD4⁺ T细胞检测能力进行质控,急需有准确CD4⁺比例量值的T淋巴细胞标准物质。将人工制备的T淋巴细胞进行纯化后,使用流式细胞术进行标准物质候选物的均匀性检验、稳定性检验。联合8家检测实验室采用流式细胞微球计数法对标准物质候选物进行协同定值。实验数据统计表明,该标准物质候选物的均匀性好,并且在-20 ℃储存条件下可稳定12个月以上,其标准量值CD4⁺比例为74.0%±6.7%（k=2）。该标准物质适用于流式细胞仪中CD4⁺细胞占总淋巴细胞的百分比项目的计量校准,以及流式细胞术检测过程的方法验证和检测结果的质量控制。     

橡胶树热激蛋白HbHSP90.8-1基因的克隆与功能分析

白粉病是橡胶树生长发育过程中主要叶部病害之一。热激蛋白90(HSP90)分子伴侣在植物逆境胁迫抗性中起着重要作用。为研究HSP90家族成员结构及其在橡胶树抗白粉病中的功能,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397叶片中克隆HbHSP90.8-1并采用生物信息学等技术对其结构和功能进行分析。结果表明,HbHSP90.8-1 cDNA序列全长2 844 bp,开放阅读框（ORF）2 454 bp,编码817个氨基酸。HbHSP90.8-1编码一个有信号肽、无跨膜结构且定位预测在内质网上的稳定亲水蛋白,存在HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域。系统进化分析结果表明橡胶树HbHSP90.8-1与木薯MeHSP90的亲缘关系最近,与麻风树JcHSP90聚为一类。通过qRT-PCR分析结果表明HbHSP90.8-1在橡胶树不同组织中均有表达,其在胶乳中的表达量最高;HbHSP90.8-1基因在白粉菌侵染、H2O2、ABA和ETH处理叶片中,表达量均呈现显著上调趋势;在MeJA和SA激素处理下,HbHSP90.8-1表达量呈现下调的趋势。说明HbHSP90...     

威岭栽培黑麦抗白粉病特性导入小麦的研究

威岭黑麦(Weiling rye)是一个高抗白粉病(Erysiphe gramininis f．sp．tritici)的中国矮杆栽培黑麦。以Weiling rye作为白粉病抗源,高感白粉病小麦栽培品种My8443为母本,从Weiling rye与小麦My8443远缘杂交的BC_2F_6后代中鉴定出一个新的小麦-黑麦易位系No．147,以实现威岭黑麦白粉病抗性向普通栽培小麦的转移。No．147及其亲本的抗白粉病特性通过苗期和成株期优势生理小种混合接种和室内单生理小种接种鉴定,改良的染色体C-分带和基因组原位杂交技术(GISH。Ge- nomic in situ hybridization)被用于鉴定小麦和黑麦的染色质,酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(APAGE)被用于鉴定黑麦醇溶蛋白1RS特异条带,11个黑麦种属特异性标记SCM(Secale cereale marker)引物被用于扩增分析黑麦特异性简单重复序列(SSR)。研究结果证实No．147是一个新的高抗白粉病的1BL/1RS小麦-黑麦染色体易位系,并对其产生的细胞学机制进行了分析。论文对中国栽培黑麦抗性基因资源的利用和该易位系在小麦遗传育种改良中的利用价值进行了讨论。     

重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用研究

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种发生于直肠和结肠的慢性非特异性炎症疾病,近年来发病率明显上升。为探究转基因牛乳中提取的重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶对改善UC的作用,采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt,DSS）构建小鼠UC模型,30只雄性C57BL/6N小鼠随机分为空白对照组（CON组）、模型对照组（DSS组）、低浓度乳铁蛋白组（L-rLF组,50 mg·kg^-1·BW^-1）、高浓度乳铁蛋白组（H-rLF组,100 mg·kg^-1·BW^-1）、低浓度溶菌酶组（L-rLZM组,50 mg·kg^-1·BW^-1）和高浓度溶菌酶组（H-rLZM组,100 mg·kg^-1·BW^-1）。造模后用重组乳铁蛋白和溶菌酶分别灌胃1周,取小鼠血清及结肠,观察器官病理变化,测定炎症因子以及肠道菌群等相关指标。研究结果显示,与模型组相比,低浓度乳铁蛋白组和低浓度溶菌酶组小鼠疾病活动指数（disease activity index,DAI）、结肠缩短量、组织病理学评分均显著降低,且结肠组织中促炎因子（IL-6、lL-1β、TNF-α）表达量、血清和肝脏中脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）浓度显著降低,高浓度乳铁蛋白处理组小鼠肠道菌群结构显著改善。表明重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶均可以不同程度地改善小鼠UC,为重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶的未来应用提供了新的思路和理论支持。     

寄生植物锁阳种子萌发方法及愈伤组织、初生吸器诱导研究

专性寄生植物锁阳以干燥肉质茎入药,为常用中药材。在锁阳的生活史中,需要经历种子萌发、芽管状器管伸长、初生吸器形成、次生吸器形成等过程,其中种子萌发和初生吸器形成是锁阳完成生活史的最基本条件。目前,触发锁阳种子萌发、初生吸器形成的植物生长调节物质的阈值和种类并不清楚,导致人工调控锁阳生活史困难及栽培收益不高。本论文运用组织培养方法,研究赤霉素、生长素和细胞分类素等多种激素交互作用对锁阳种子萌发和吸器形成的影响。研究结果显示：（1）多种激素的共同作用促进锁阳球形原胚的发育。（2）B₅培养基添加1.0 mg·L^-1 2,4-D,0.5 mg·L^-1 KT,1.0 mg·L^-1 GA₃可以高效诱导锁阳种子愈伤组织形成,愈伤诱导率达13.7％±3.1%。（3）B₅培养基添加0.5 mg·L^-1 2,4-D,0.25 mg·L^-1 KT可以高效诱导锁阳愈伤组织分化初生吸器,一些初生吸器继续分化成芽管状气管,延伸3~4 cm后,顶端膨大,形成新的初生吸器。本论文研究结果可为进一步研究锁阳种子萌发、初生吸器形成的内源激素变化规律及发生机制研究奠定基础。     

脱甲河水系CH4关键产生途径及其稳定碳同位素特征

为明确脱甲河溶存CH₄关键产生途径,明晰水系碳同位素组成及其分布特征,为小流域CH₄排放估算和减排提供数据支撑.利用双层扩散模型法估算了CH₄浓度和传输通量,研究了周年内脱甲河4级河段(S₁～S₄)水体CH₄通量的时空分布及其主控环境因子;运用稳定同位素方法探究了溶存CH₄关键产生途径,分析了溶解CH₄、悬浮颗粒物和沉积物有机质δ¹³C分布特征.结果表明: 水体pH均值为(7.27±0.03),各河段四季差异均显著;溶解氧(DO)在0.43～13.99 mg·L^-1内变化,S₁河段DO浓度最高且夏、秋季差异显著,其他河段均为冬与春、夏、秋季差异显著;可溶性有机碳(DOC)变化范围是0.34～8.32 mg·L^-1,由S₁至S₄河段总体呈递增趋势;水体电导率(EC)和氧化还原电位(ORP)变化范围分别是17～436 μS·cm^-1和-52.30～674.10 mV,各河段差异明显;铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)浓度分别在0.30～1.35(平均0.90±0.10) mg·L^-1和0.82～2.45 (平均1.62±0.16) mg·L^-1内变化.溶存CH₄浓度和传输通量变化范围分别是0～5.28 (平均0.46±0.06) μmol·L^-1和-0.34～619.72 (平均53.88±7.15) μg C·m^-2·h^-1;均存在时空变化且变异规律相似,为春季>冬季>夏季>秋季,S₂>S₃>S₄>S₁.通量与水体铵态氮和DOC浓度均呈显著正相关.各级河段均以乙酸发酵产甲烷途径为主导,但不同河段差异明显,乙酸发酵途径产CH₄贡献率以S₁河段最高(87%),其次为S₄(81%),S₂、S₃分别达到78%和76%.溶存CH₄、悬浮颗粒物和沉积物有机质的δ¹³C均值分别为-41.64‰±1.91‰、-14.07‰±1.06‰和-26.20‰±1.02‰,溶存甲烷δ¹³C与沉积物有机质的δ¹³C呈显著正相关,与其传输通量呈极显著负相关.     

香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究

对香蕉皮提取物（banana peel extraction,BPE）的体外抗氧化作用和抗肿瘤活性进行了研究。使用福林酚和硝酸铝法测定BPE中总多酚和总黄酮含量;通过检测DPPH和O₂^-自由基清除能力测定BPE的体外抗氧化活性;采用Alamar Blue法检测BPE对HepG2细胞活性的影响;荧光染色及流式技术检测HepG2细胞凋亡;免疫印迹技术检测凋亡蛋白的变化;Caspase活性检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9的活性;Caspase-9和Caspase-3抑制剂验证BPE抗肿瘤相关的信号转导通路。结果表明,BPE中总多酚和总黄酮含量分别为39.23 ± 2.35 mg·L^-1和26.53 ± 1.97 mg·L^-1;BPE显示出一定的DPPH和O₂^-自由基清除能力（65.31%±3.82%和51.29%±4.23%）,可明显抑制HepG2细胞的增殖（IC₅₀=54.32 mL·L^-1）;BPE通过上调Caspase-3、Bax、Bid、Apaf-1、Bak、p53、Caspase-9的表达,下调Bcl-2、Bcl-xl的表达诱导HepG2细胞凋亡;Caspase-9和Caspase-3抑制剂（Z-LEHD-FMK、Ac-DEVD-CHO）在一定程度上逆转了BPE的增殖抑制活性。BPE具有一定的自由基清除能力,对HepG2细胞具有明显增殖抑制作用,这些结果为香蕉皮的进一步开发利用提供了数据支撑。     

固相萃取与气相色谱⁃质谱法联用测定食用植物油和含脂肪食品中氯丙醇酯的方法验证研究

氯丙醇酯是国际上广泛关注的食品加工过程污染物,其水解产物氯丙醇对人体（特别是婴幼儿）危害风险较大。采用固相萃取与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）联用技术,对食用植物油和含脂食品中的氯丙醇酯[3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（简称3-MCPD酯）和2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯（简称2-MCPD酯）]进行检测。该方法准确度高（3-MCPD酯和2-MCPD酯的平均回收率分别为98.9%和96.5%)、灵敏度高(3-MCPD酯和2-MCPD酯的检出限分别为0.042 mg·kg^-1和0.058 mg·kg^-1)、重现性好(相对标准偏差均低于5%)。76批次监测样品中,3-MCPD酯和2-MCPD酯的含量分别为0.042~4.865 mg·kg^-1(平均值为0.773 mg·kg^-1)和0.058~2.592 mg·kg^-1(平均值为0.469 mg·kg^-1)。经机构间的协同验证和英国FAPAS样的能力验证,2种氯丙醇酯在0.200~3.000 mg·kg^-1范围内线性良好,为进一步研究奠定了基础,同时也为食品加工企业严格控制生产过程建立了一种可行的检测方法。     

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测小麦基因组DNA RAPD扩增产物的方法学比较

通过20%(wv)的琼脂糖凝胶和5%(wv)的聚丙烯酰胺凝胶电泳对小麦白粉病抗、感特性品种基因组DNA的RAPD检测结果表明:5%聚丙烯酰胺凝胶对线性DNA分子(01～20kb)和长度相差100bp以下的DNA分子的分离较20%的琼脂糖凝胶电泳效果好。因此,我们研究出了一项利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测小麦白粉病抗、感特性的新技术,在工作中建立了一种适合于检测小麦基因组DNA结构差异的电泳方法。该方法主要包括:(1)丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的新配比;(2)分离DNA片段的最佳凝胶浓度;(3)电泳条件;(4)脱色、漂洗、银染、显色过程。实验发现,该技术对于小麦白粉病抗、感特性检测中的小片段和长度相差100bp以下的线性DNAPCR扩增结果的分辨效果较好。应用该技术在抗感品种间已经发现了DNA水平上的差异。