近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达*

根据纯化得到的（R）-专一性羰基还原酶（rCR）蛋白质测序结果推导出的核苷酸序列设计引物,以筛选得到的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明rcr基因全长1011bp,共编码336个氨基酸,分子量为35．9kD。将序列递交NCBI比对,与醇脱氢酶超家族成员序列同源性达99％。在大肠杆菌（Escherichia coli）JM109中表达rcr基因,重组菌可还原β-羟基苯乙酮得到（R）-苯乙二醇,光学纯度为100％e．e,摩尔产率为80．4％,在反应体系中无需外加辅酶再生系统即可完成转化。     

福建地区94例女性阴道念珠菌感染分离株分型研究

目的 对福建地区临床阴道分泌物分离出的（94株）念珠菌菌株进行分类鉴定,并通过分子生物学及API试验分析传统科玛嘉分类方法的准确性.方法 ①通过科玛嘉显色培养基鉴定菌种,并观察菌株显微镜下形态学表现.②通过ITS区段分子生物学序列分析进行菌种鉴定.③将科玛嘉试验与ITS区段序列分析结果与化验室检验报告结果对比,将鉴定差别菌株进一步行API试验及LSU区段序列分析.结果 ①94株念珠菌经鉴定结果为白念珠菌78株、光滑念珠菌10株、近平滑念珠菌3株、热带念珠菌1株、酿酒假丝酵母菌1株及其中1株为光滑念珠菌及近平滑念珠菌混合感染.②科玛嘉试验可良好的鉴定念珠菌,但对于少见菌种（如酿酒假丝酵母菌）仍缺乏特异性.③一般化验室通过简单菌落形态学及简易科玛嘉检测鉴定仍存在一定误差率（10/94）.④分子生物学方法鉴定菌种准确性高,且可从基因序列分析中鉴定包含C.parapsilosis sensu strico,Candida metapsilosis以及Candida orthopsilosis的近平滑念珠菌复合体菌种.结论 福建地区女性外阴感染的菌种仍以白念珠菌为主,但非白念珠菌的感染也占据相当的比例（16/94）,而在检测方法上,分子生物学技术较科玛嘉试验更能准确的鉴定念珠菌菌种.     

口腔黏膜真菌鉴定方法的比较

比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株;50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candida metapsilosis 1株,Lodderomyces elongisporus 1株,克柔假丝酵母菌(Candida krusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明:ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。     

一株产虾青素酵母菌株的鉴定

从市售海水鱼内脏中分离得到一株产虾青素的酵母,编号为NZ- 01.采用传统形态学鉴定方法及rDNA序列分析法分别对从NZ- 01进行鉴定.形态学鉴定结果表明该菌为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),分别用特异性引物对rDNA 序列的18S rDNA D1/D2区、26S rDNA D1/D2区和ITS区进行扩增,PCR产物测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,结果均与形态学观察结果一致,NZ- 01为胶红酵母.     

假丝酵母属疑难菌株大亚基rDNAD1／D2区域序列分析及其分类学意义

对根据常规形态和生理生化性状难以确定分类学地位的8株假丝酵母菌,进行了以大亚基（26S）rDNA中D1/D2区域（均500-600bp)的碱基序列分析为依据的分子分类学研究。根据系统树上所显示的供试菌株与假丝酵母属及相关子囊菌酵母已知种的亲缘关系,以及与最近缘种模式菌株D1/D2区域序列的相似性比较,确定了各个菌株的归属,本研究也显示了DNA序列分析在假丝酵母菌快速鉴定中的优越性。     

一株甲基对硫磷降解菌-布朗克假丝酵母JMUPMD-1的分离与鉴定

对一株新分离的、能以甲基对硫磷为唯一磷源生长的菌株JMUPMD-1,利用形态特征观察和生理生化特性,及结合rDNA ITS分子序列分析对JMUPMD-1进行鉴定;采用气相色谱法检测培养过程中甲基对硫磷浓度的变化,确定甲基对硫磷降解速率。该菌株的rDNA ITS序列与布朗克假丝酵母（Candida blankii）的同源性为99％。形态特征和生理生化特性与布朗克假丝酵母相符合,因此鉴定为布朗克假丝酵母。以350μg／L甲基对硫磷为唯一磷源和350μg／L甲基对硫磷及1g／L K2HPO4组成的混合磷源培养该菌株,测得该菌株的降解率为48．6％。该菌株的胞内提取液具有明显的甲基对硫磷降解酶活性。     

额尔齐斯河白斑狗鱼假尾复口吸虫的分子鉴定

利用分子生物学方法对采自额尔齐斯河（中国段）的白斑狗鱼（Esox lucius Linnaeus）晶状体内寄生的复口吸虫（Diplostomum）进行了种类鉴定,结果显示其种类为假尾复口吸虫（D.paracaudum）,为中国新记录种。通过PCR扩增待鉴定种的部分18S-ITS1-5.8S序列,测序后与GenBank中假尾复口吸虫的序列进行比对,发现其相似度达到99.6%。将该序列与7种复口吸虫的ITS1序列进行比对后构建系统进化树,进化树以单殖吸虫Gyrodactylus parvae为外类群,结果显示:待鉴定种与假尾复口吸虫（D.paracaudum）聚为一支,其支持率达到了50%以上,支持它们为同一虫种。     

四种贺兰山紫蘑菇rDNA ITS序列分析

对4种紫蘑菇的rDNA ITS区段进行克隆测序和序列特征比较分析,并与GenBank检索获得的相似性最高菌株的ITS序列一起计算遗传距离并构建系统发育树,旨在探索紫蘑菇的分子鉴定方法及亲缘关系.结果显示,CM-1、CM-2、CM-3及CM-4四种紫蘑菇均属于丝膜菌(Cortinarius),分别与C.rufoolivaceus、C.coerulescens、C.humolens和C.calochrous序列进行比对后,均显示了较高的遗传相似性.贺兰山紫蘑菇隶属于丝膜菌属(Cortinarius).     

慢性前列腺炎患者假丝酵母菌感染及耐药性分析

目的 了解慢性前列腺炎与假丝酵母菌感染的相关性及假丝酵母菌的耐药性。方法 采用常规沙堡平板分离360例慢性前列腺炎患者的前列腺液标本中的假丝酵母菌,疑似菌落用ATB Expression鉴定仪进行鉴定。采用ATB-Fungus真菌药敏板,对假丝酵母菌株进行药敏试验。结果 11．7％前列腺液标本（42／360）似丝酵母菌阳性,其中自假丝酵母菌23例（54．7％）,近平滑假丝酵母菌13例（30．9％）,其它6例（14．3％）。假丝酵母菌菌株对两性霉素B和制霉菌素敏感率均为100％,其次为酮康唑,敏感率为97．0％;对5-氟胞嘧啶耐药性最强,其耐药率为56．5％。结论 白假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌是慢性前列腺炎假丝酵母菌感染的优势菌种,假丝酵母菌株最敏感的药物是两性霉素B和制霉菌素。     

休哈塔假丝酵母转化木糖和葡萄糖为乙醇的发酵转录谱

[目的]探究木糖发酵典型菌株休哈塔假丝酵母在己糖和戊糖发酵中的转录谱及差异,筛选出与木糖利用和乙醇发酵代谢途径及调控相关的关键性酶和功能蛋白质基因.[方法]应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium分别构建了休哈塔假丝酵母木糖、葡萄糖发酵的cDNA文库,并进行De novo转录组的表达序列标签大规模测序和序列比较分析,进而挖掘出该酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的相关基因.[结果]分别对木糖和葡萄糖发酵样本进行二分之一RUN测序并各自得到60万条reads,序列平均长度400 bp.共拼接得到7250条(木糖)和7168条(葡萄糖)contigs,并利用BLAST对木糖样品和葡萄糖样品中的2421个基因(contig)和2456个基因(contig)进行了功能注释和GO分类.通过两个文库间的序列对比分析,共发现158个基因属于差异表达状态(P＜0.05).基于经典的糖酵解及乙醇发酵途径筛选出与木糖乙醇发酵相关的候选基因,并且比较分析其转录水平的差异.[结论]基于大规模转录谱测序和比较分析首次筛选出休哈塔假丝酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的基因群,可为后续的分子生物学及代谢调控研究提供基础数据.     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因的克隆及序列分析

目的-克隆阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(AK)基因,并测定其序列,进行序列分析。方法-根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。结果-PCR扩增得到特异的阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的PT-AK重组质粒。测序表明,所克隆的AK基因大小为690bp,编码229个氨基酸。序列分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性(99．9％)。结论-克隆了阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因,序列测定及同源性分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性。     

Genomic sequencing and comparative analysis of Epstein-Barr virus genome isolated from primary nasopharyngeal carcinoma biopsy

Whether certain Epstein-Barr virus (EBV) strains are associated with pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC) is still an unresolved question. In the present study, EBV genome contained in a primary NPC tumor biopsy was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR), and sequenced using next-generation (Illumina) and conventional dideoxy-DNA sequencing. The EBV genome, designated HKNPC1 (Genbank accession number JQ009376) is a type 1 EBV of approximately 171.5 kb. The virus appears to be a uniform strain in line with accepted monoclonal nature of EBV in NPC but is heterogeneous at 172 nucleotide positions. Phylogenetic analysis with the four published EBV strains, B95-8, AG876, GD1, and GD2, indicated HKNPC1 was more closely related to the Chinese NPC patient-derived strains, GD1 and GD2. HKNPC1 contains 1,589 single nucleotide variations (SNVs) and 132 insertions or deletions (indels) in comparison to the reference EBV sequence (accession number NC007605). When compared to AG876, a strain derived from Ghanaian Burkitt's lymphoma, we found 322 SNVs, of which 76 were non-synonymous SNVs and were shared amongst the Chinese GD1, GD2 and HKNPC1 isolates. We observed 88 non-synonymous SNVs shared only by HKNPC1 and GD2, the only other NPC tumor-derived strain reported thus far. Non-synonymous SNVs were mainly found in the latent, tegument and glycoprotein genes. The same point mutations were found in glycoprotein (BLLF1 and BALF4) genes of GD1, GD2 and HKNPC1 strains and might affect cell type specific binding. Variations in LMP1 and EBNA3B epitopes and mutations in Cp (11404 C>T) and Qp (50134 G>C) found in GD1, GD2 and HKNPC1 could potentially affect CD8(+) T cell recognition and latent gene expression pattern in NPC, respectively. In conclusion, we showed that whole genome sequencing of EBV in NPC may facilitate discovery of previously unknown variations of pathogenic significance.     

Mutational analysis of substrate specificity in a <Emphasis Type="Italic">Citrus paradisi</Emphasis> flavonol 3-<Emphasis Type="Italic">O</Emphasis>-glucosyltransferase

Citrus paradisi 3-O-glucosyltransferase (Cp3GT, Genbank Protein ID: ACS15351) and Citrus sinensis 3-O-glucosyltransferase (Cs3GT, Genbank Protein ID: AAS00612.2) share 95% amino acid sequence identity. Cp3GT was previously established as a flavonol-specific 3-O-glucosyltransferase by direct enzymatic analysis. Cs3GT is annotated as a flavonoid-3-O-glucosyltransferase and predicted to use anthocyanidins as substrates based on gene expression analysis correlated with the accumulation of anthocyanins in C. sinensis cv. Tarocco, a blood orange variety. Mutant enzymes in which amino acids found in Cs3GT were substituted for position equivalent residues in Cp3GT were generated, heterologously expressed in yeast, and characterized for substrate specificity. Structure–function relationships were investigated for wild type and mutant glucosyltransferases by homology modelling using a crystallized Vitis vinifera anthocyanidin/flavonol 3-O-GT (PDB: 2C9Z) as template and subsequent substrate docking. All enzymes showed similar patterns for optimal temperature, pH, and UDP/metal ion inhibition with differences observed in kinetic parameters. Although changes in the activity of the mutant proteins as compared to wild type were observed, cyanidin was never efficiently accepted as a substrate.     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC₅₀为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

草莓钙依赖蛋白激酶基因的克隆与表达分析

以EST测序结合RACE技术,从久香草莓的茎尖中分离得到一个新基因,BLASTX分析显示这是一个钙依赖蛋白激酶编码基因,与GenBank中的FaCDPK1同源,命名为FaCDPK2,GenBank登录号为HQ829293.采用半定量RT-PCR对FaCDPK2基因在不同组织中的表达分析表明,FaCDPK2全长3 775 bp,读码框1 659bp,由12个外显子组成,编码552个氨基酸残基,在第89~349位是保守的蛋白激酶结构域,C端含4个EFhand钙结合域.该基因编码蛋白与拟南芥CPK28序列一致性为86.25%,与草莓FaCDPK1序列一致性为43.99%.表达分析显示该基因表达范围较广,在所分析的七种草莓组织材料中,以花中表达水平最高,在果实中的表达可能受成熟的诱导.     

平菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从平菇（Pleurotus ostreatus）8个菌株中筛选出3株高产植酸酶菌株,并根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以平菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约920 bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为919 bp.采用blast进行序列比对,结果表明：该片段与曾报道的源于Trametes pubescens的植酸酶phyA（GenBank Accession：AJ310700）基因相比较,其DNA序列同源性为93%.该片段含有3个内含子,含有植酸酶基因的活性位点保守序列（Active-site sequence）RHGARYPT.     

猪圆环病毒2型的PCR检测方法应用

本研究登录Genbank对猪圆环病毒2型基因的序列进行分析,用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物,试图选择一种比较合理的PCR方法检查PCV2感染的病原,以期这种PCR方法可以有效分析猪综合征障碍病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒的扩增(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等比较常见的病原。研究结果表明,在PCV2进行扩增阳性样品检测中,发现一条异常447 bp的DNA条带,对产物测序结果进行扩增分析,证明其是PCV ORF2基因序列。敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度时达到了9.8×10^-4ng/μL。PCR实验具有良好的稳定性和重复性。根据对66例临床病猪的分析表明,在PCV2的检测中阳性感染率是27.26%,这可能受到HCV、PRRSV、PRV、PPV等多种病毒的感染,其中混合感染的比例达到了72.23%。