抗人P185^erbB2嵌合抗体的CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体（HAMA）反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185^erbB2人／鼠嵌合抗体,将抗人P185^erbB2单抗C25的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱地劝的选择标志基因的真核表达载体中,共转染CHO－dhfr^-细胞,经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达,采用RT－PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化等实验证实了所表达的抗人P185^erbB2嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达100mg/L,所表达的嵌合抗体具有抑制P185^erbB2高表达肿瘤细胞增殖的作用。     

含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建

目的构建含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,观察其在293T细胞中的表达。方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶（Furin）／口蹄疫病毒2A多肽（F/2A）连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框（ORF）,插入慢病毒表达载体pWPI,构建重组抗P185神睨全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI／H-F2A—L。以已构建的慢病毒表达载体pWPI／H-IRES-L为对照质粒。应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体3质粒系统共转染入293T细胞进行包装,测定病毒滴度。再感染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达和转染效率,RT—PER、ELISA方法分别检测嵌合抗体mRNA和蛋白的表达。结果经测序鉴定,pWPI／H—F2A—L与预期设计一致;pWPI／H—F2A—L组的病毒滴度为4．3×10^5TU／ml,而pWPI／H—IRES—L组的病毒滴度为3．5×10^5TU／ml;两组重组慢病毒的转染效率分别为87．68％和79．08％;两组重组慢病毒感染293T细胞后,都有嵌合重链和嵌合轻链的表达,由F／2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。结论成功构建了含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,为今后抗P185^erbB2工程抗体的研究奠定了基础。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv—突变人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体,轻链可变区突变体-突变体hhTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子。结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,混合复合结果未获得活性产物。     

Vsig4 和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化

目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白Ig G3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用。方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠Ig G3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞。Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力。结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系。经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合。结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础。     

p185蛋白及其抗体的研究进展

描述了p185在信号转导过程中的功能,讨论了抗p185抗体的蛋白质工程及它们在肿瘤治疗中的应用.     

人干扰素α2b和IgG Fc片段融合蛋白显著延长体内半衰期

重组人干扰素α(rHuIFNα)已被广泛用于临床治疗多种人类病毒性疾病和肿瘤。但IFNα在体内半衰期较短从而导致IFNα在用药后数小时即从血浆中被清除。目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长IFNα的半衰期。在本研究中, 构建了IFNα2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达, 并有部分糖基化。不同亚型Fcγ片段的融合蛋白对IFNα2b抗病毒活性均有一定影响。其中IFNα2b-Fcγ2所受影响最小, 较单纯的IFNα2b降低了2.3倍, 抗病毒活性可达4.29x107 IU/mg, 大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65 h, 血液中存留时间120 h以上, 比商品重组干扰素的体内半衰期延长约8倍, 血液存留时间延长10倍, 显示了其良好的临床应用 前景。     

基质金属蛋白酶-2和p185HER-2/neu蛋白在卵巢癌中的研究进展

基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)是基质金属蛋白酶家族的重要成员,能降解明胶蛋白和Ⅳ型、V型胶原,在细胞外基质的降解过程中起着关键作用,能够促进肿瘤细胞发生侵袭和转移。p185HER-2/neu蛋白是一种相对分子质量185×103的跨膜糖蛋白,由HER-2/neu基因编码,属于酪氨酸激酶受体家族,p185HER-2/neu蛋白在人类多种癌症中存在扩增及过量表达,并与肿瘤的侵袭性表型及生存期短密切相关。就基质金属蛋白酶-2和p185HER-2/neu蛋白的生物学特性,与卵巢癌侵袭转移和预后的关系及MMP-2和p185HER-2/neu蛋白的研究情况等予以综述。     

hsRAGE-IgG Fc融合蛋白的表达及其生物学活性

将编码人可溶性晚期糖基化终产物受体-免疫球蛋白G Fc段(hsRAGE-IgG Fc)融合蛋白的DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-20b中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并表达。SDS-PAGE分析表明其表达形式为包涵体,相对分子质量约为66kDa,表达量占菌体总蛋白的38.4%。经复性后,获得纯度为96.6%的融合蛋白,得率约为29.5mg/L。经Western印迹法鉴定,该融合蛋白可与sRAGE抗体产生阳性反应。同时,hsRAGE-IgG Fc融合蛋白可以显著抑制晚期糖基化终产物(AGE)引起的ECV-304细胞NF-κB p65表达的上调,其活性与hsRAGE相似。     

抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体 (HAMA)反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185 erbB2 人 /鼠嵌合抗体 ,将抗人P185 erbB2 单抗C2 5的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱动的选择标志基因的真核表达载体中 ,共转染CHO dhfr-细胞 ,经G418及氨甲喋呤 (MTX)梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达。采用RT PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化学等实验证实了所表达的抗人P185 erbB2 嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达 10 0mg/L ,所表达的嵌合抗体具有抑制P185 erbB2 高表达肿瘤细胞增殖的作用     

线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析

目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。     

Autoantibody to p185 erbB2/neu oncoprotein by vaccination with xenogenic DNA

 The passive transfer of antibodies and vaccination procedures against p185, the erbB2/neu oncoprotein, are approaches being explored for treatment of human breast cancer. We now report the possibility of using the erbB2/neu gene as an immunogen. This study demonstrates that intramuscular or intradermal injections of rat neuNT full-length DNA into mice generate anti-p185 autoantibodies. Anti-p185 polyclonals were also shown to bind the homologous human receptor ErbB2 and to stain specimens of breast adenocarcinoma from both neu-transgenic mice and humans. Further, in vitro assays demonstrated that anti-p185 IgG (probably dependent on CD4⁺ Th1) were able to inhibit human SKBR3 tumour cell growth and to mediate their lysis by natural killer cells. The continuous presence of circulating neu autoantibodies in mice did not cause any discernible toxic effects on normal tissues expressing low levels of self-antigen, even after 1 year. Received: 29 August 1996 / Accepted: 31 October 1996     

SDH-SV2C-L4融合蛋白的表达及山梨糖脱氢酶活性检测

目的:构建SDH-SV2C-L4融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达具有山梨糖脱氢酶(SDH)活性的融合蛋白。方法:将C亚型突触囊泡蛋白2大突环L4(SV2C-L4)基因与SDH基因以GGGS柔性接头连接,在大肠杆菌DH5α中表达;用NBT染色和DCIP脱色的方法检测融合蛋白的SDH活性。结果:DNA测序及SDS-PAGE结果显示构建了融合蛋白表达载体,并表达了SDH-SV2C-L4融合蛋白,相对分子质量约80×103;DCIP脱色及NBT染色均检测到融合蛋白的SDH活性。结论:与SV2C-L4融合的SDH仍具有活性,为下一步SV2C-L4活性检测方法的建立及SDH与SV2C-L4的其他相关研究奠定了基础。     

抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析

目的:构建多基因表达载体,在大肠杆菌中同时表达AFP单链抗体(scFv)和蓝藻别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白(apcA)组成的融合蛋白(scFv-apcA)、藻胆蛋白裂合酶(cpcS)及藻红蛋白生物合成酶(Ho1和pebS),获得共价结合藻红胆素的融合蛋白(scFv-apcA-PEB)。方法:利用融合PCR将scFv和apcA基因连接起来,形成scFv-apcA融合基因,并将该融合基因与cpcS克隆到表达载体pCDFDuet-1中;将Ho1和pebS基因克隆到表达载体pRSFDuet-1中。将两种载体共转化到大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白表达,经亲和层析获得重组蛋白,通过光谱学分析和抗体竞争性抑制法,测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功表达融合蛋白scFv-apcA-PEB,分子质量约为45kDa,与理论值相符,其最大吸收峰为549.5nm,最大荧光发射峰为560nm,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到48%。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了同时具有荧光特性和免疫学活性的重组蛋白。     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT2-EGFP融合蛋白的表达与鉴定

谷氨酰胺转运蛋白是中枢神经系统中一种重要的中性氨基酸转运蛋白,对谷氨酰胺的跨膜转运十分重要。为了更方便地研究大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)在细胞膜上的表达与定位,利用亚克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构建于SNAT2的C端,通过菌液PCR、酶切和DNA测序鉴定重组真核表达质粒;将测序正确的重组质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T cells),用Western blot和激光共聚焦电子显微镜荧光检测技术鉴定SNAT2-EGFP的表达与亚细胞定位。结果表明,SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒在细胞中表达并正确定位于细胞膜上。SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒的成功构建为今后深入研究SNAT2的结构和功能提供了一个有效的工具。     

人重组IL6／IL2融合蛋白的变性、复性及纯化

经超声破碎,分离已表达CH925包涵体,较系统地研究变性剂浓度、融合蛋白浓度对蛋白折叠的影响.在还原型及氧化型谷胱甘肽复性条件下,成功地将融合蛋白CH925折叠成具有IL6及IL2双活性蛋白,IL6的比活为2.3×10⁸U/mg, IL2比活为2.2×10⁶U/mg.经阴离子交换、凝胶过滤层析,获得一定纯度的CH925,配合反相HPLC.洗脱收集蛋白峰,CH925纯度为98%.     

富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定

Her2/c-erbB-2基因（其产物为膜蛋白p185）是表皮生长因子受体（EGFR）基因家族的一员,在约30％的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T-1载体后,转化大肠杆菌Origami B（DE3）pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS-PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Western blot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。P185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。     

Genetic immunization against neu /erbB2 transgenic breast cancer

erbB2/neu, an overexpressed oncogene product, has been proposed as a human cancer vaccine target. In the present study, transgenic (rat neuNT oncogene) FVB/neu mice, developing metastasizable mammary carcinoma, were immunized with a plasmid DNA encoding are not tolerant to the self antigen and sequences. We report that transgenic tumour-bearing mice, like some breast cancer patients erbB2+X, develop anti-neu autoimmune responses, which can be boosted and skewed to a Th1 phenotype by DNA immunization. Intramuscular injections of neuNT plasmid drastically reduced (or even prevented in a small number of treated mice) the outgrowth of mammary neoplasms as well as their metastatic penetrance. Furthermore, DNA immunization caused haemorrhagic necrosis of established cancer nests, leaving a greatly reduced portion of the tumour burden for the host to cope with. The antitumour activities we obtained, in this very challenging model for cancer immunotherapy, lay the foundation for DNA-based immunization to control erbB2/neu-overexpressing neoplasms. Received: 19 April 1998 / Accepted: 20 August 1998