拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.     

用于植物基因研究的mCherry表达载体构建及定位表达

荧光蛋白在生物学研究中具有广泛的应用和重要的作用,其中红色荧光蛋白mCherry因其颜色和良好的特性,对于植物基因研究具有重要的使用价值,本研究将mCherry基因构建到pBI121植物表达载体系统中,构建了pBI121MCS-mCherry载体。利用基因枪转化法转入洋葱表皮进行表达验证,显微镜观察结果显示整个洋葱细胞具有红色荧光,证明该载体能够在植物细胞中表达红色荧光蛋白。利用双酶切连接法将转录因子BpMYB4基因构建到该载体上,得到融合表达载体pBI121MCS-mCherry-BpMYB4,在洋葱表皮中表达,结果显示细胞核具有红色荧光,证明该载体能够准确表达融合蛋白,进行亚细胞定位。同时融合基因时不再需要中间载体,构建简便,引入的KpnⅠ酶切位点,增加了可选择性。因此该载体可用于植物基因表达定位及转基因植株筛选研究中,为今后的白桦基因组学研究提供了材料。     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

拟南芥血红蛋白1(AtGLB1)与过氧化氢的相互作用

拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)属于非共生的血红蛋白。在低氧胁迫中对植物细胞中过氧化氢(H2O2)内稳态的维持起了很重要的作用。为了检测AtGLB1与H2O2能否直接相互作用,我们扩增了拟南芥的AtGLB1基因,并将其克隆到原核表达质粒pET32a中,测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导目的蛋白表达后,镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化了靶蛋白。体外表达的氧合的AtGLB1能与H2O2直接相互作用。因此,与H2O2反应可能是AtGLB1清除低氧胁迫下产生的H2O2的一种方式。     

利用放线菌酮提高黄素单氧化酶FMO_(GS-OX1)亚细胞定位的准确性

研究蛋白质亚细胞定位的常规方法是构建由35S启动子驱动目的基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的表达载体,在细胞中瞬时或稳定表达来确定该蛋白质在细胞中的定位。35S启动子的优势是能够获得较强的GFP信号,但同时也可能因为蛋白质合成量过大,导致部分蛋白滞留在运输途径中或出现在其真实定位以外的区域。为了解决这一问题,以模式植物拟南芥中黄素单氧化酶FMOGS-OX1为例,利用蛋白质抑制剂放线菌酮处理过量表达FMOGS-OX1-GFP融合蛋白的烟草叶片。结果表明:未经放线菌酮处理的烟草叶片表皮细胞,细胞质和内质网中均呈现了较强的荧光信号,放线菌酮处理后,内质网上的信号消失,而细胞质则呈现出稳定的信号,因此判断FMOGS-OX1合成后可能是经过内质网运输到细胞质中的。上述结果证明适当的放线菌酮处理,能够避免强启动子驱动报告基因造成的蛋白质合成过量的问题,可有效地提高蛋白质亚细胞定位的准确性。     

盐爪爪Na^＋/H^＋逆向转运蛋白和焦磷酸酶的亚细胞定位

将盐爪爪Na+/H+逆向转运蛋白基因(KfNHX1)和焦磷酸酶基因(KfVP1)分别构建至植物表达载体,利用基因枪介导的方法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察研究其亚细胞定位.结果表明,转化了KfNHX1(或KfVP1)-GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞仅膜系统散发荧光,而对照组即未转入KfNHX1(或KfVP1)基因的细胞则整体均匀发出荧光.说明KfNHX1和KfVP1可能定位于细胞的膜系统,作为跨膜转运蛋白在离子的调控运输中发挥重要作用.     

拟南芥中ELO家族同源基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法,克隆了拟南芥中可能参与超长链脂肪酸合成的ELO家族同源基因At1g75000、At4g36830和At3g06470的全长cDNA,构建其与eGFP基因融合的植物表达载体At1g75000::eGFP::NOS/pPZP211、At4g36830::eGFP::NOS/pPZP211和At1g06470::eGFP::NOS/pPZP211,并利用基因枪介导法将构建的植物表达载体转入洋葱表皮细胞,并在荧光显微镜下检测到了绿色荧光信号.为进一步研究拟南芥中AtELO家族同源基因的功能奠定基础.     

水稻OsRhoGDI2蛋白生物信息学分析及亚细胞定位研究

水稻OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的小G蛋白Rho家族成员OsRacD的互作蛋白的编码基因,为研究OsRhoGDI2和OsRacD的相互作用特点和调控机制,对OsRhoGDI2进行了生物信息学分析和亚细胞定位检测。通过生物信息学方法比较了二者编码蛋白的理化性质、修饰位点和亚细胞定位特点,并进一步构建了受控于CaMV35S启动子的与绿色荧光蛋白融合表达的OsRhoGDI2基因的双元植物表达载体,采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察了融合蛋白在活细胞内分布特点。OsRhoGDI2和OsRacD具有一些相似的理化特性和翻译后修饰位点,在洋葱表皮细胞中,OsRhoGDI2主要分布在细胞质、细胞膜和细胞核。OsRhoGDI2与OsRacD在蛋白理化特性和胞内分布上存在一定的相关性,OsRhoGDI2蛋白可能在调控OsRacD的胞内分布和活性中发挥重要作用。     

AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress

Hydrogen peroxide (H2O2) as a widespread molecule plays an important role in plant stress responses. Here, we showed that an Arabidopsis line overexpressing hemoglobin 1 (AtGLB1) can enhance its tolerance to severe hypoxic stress. In our research, Arabidopsis lines with different hemoglobin levels were employed to study the relationship between H2O2 level and the tolerance to hypoxic stress. The relatively low endogenous H2O2 level of AtGLB1-overexpressing plants could be one of the main factors for the increased tolerance of plants to hypoxic stress. Further investigation indicated that the activity of the antioxidant system involved in scavenging H2O2 increased in all three lines examined during hypoxic treatment, while only the line overexpressing AtGLB1 could retain these relatively high levels up to 48 h of the treatment, suggesting that the antioxidant system might play a role in the low H2O2 level of Arabidopsis overexpressing AtGLB1.     

洋葱卵细胞的分离

将洋葱的胚珠置于酶液中酶解50-110 min后剥去其珠被,可清楚地看到珠心中的胚囊轮廓。用解剖针将珠心从中部横切,然后挤压其珠孔部位,卵器细胞从胚珠的切口处逸出。再用显微操作仪的玻璃针将卵细胞和两个助细胞分开,达到分离洋葱卵细胞的目的。酶对分离卵细胞具有重要作用,在最佳的酶液浓度[0.02%果胶酶Y23、0.08%果胶酶（Serva）、0.05%纤维素酶和0.05%半纤维素酶]下酶解胚珠110 min后,解剖1 h可从24个胚珠中分离出10个卵细胞（41.67%）。随着胚囊的发育,两个助细胞的体积出现明显的二形性。洋葱生活卵细胞的分离为开展洋葱离体受精建立了基础,也为研究洋葱卵器细胞的发育创造了条件。     

Effects of nitric oxide scavengers on thermoinhibition of seed germination in <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis thaliana</Emphasis>

Plant seeds sometimes do not germinate at elevated temperature. The thermoinhibition mechanisms of seed germination have yet not revealed. Here we describe a chemical approach to improve seed germination at high temperature. We compared the temperature response of germination between wild-type Arabidopsis thaliana and its T-DNA insertion mutant ΔAtGLB3 that lacks a functional gene encoding GLB3, a homologue of bacterial truncated Hb (trHb). Under optimal temperature conditions (e.g. 22°C), the seeds of ΔAtGLB3 and the wild type germinated at a frequency near 100%. In contrast, at 32°C the seeds of ΔAtGLB3 did not germinate while wild-type seeds retained the same high germination frequency. The germination of ΔAtGLB3 at 32°C was partially restored by supplementation with the nitric oxide-specific scavenger 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (carboxy-PTIO; cPTIO), 3-(3,4-dihydroxycinnamoyl)quinic acid, bovine serum Hb, or isoprene. The results presented in this study suggest that chemical scavengers for reactive nitrogen species potentially improve seed germination at high temperature.     

兴化香葱降血脂作用的实验研究

研究了兴化香葱对高脂饲料喂养的鹌鹑血脂水平和肝脏脂肪化程度的影响。鹌鹑采食高脂饲料12天后,血清总胆固醇（TC）和总甘油三酯（TG）分别升高至原来的7倍和3倍。此后按500mg/（kg.d）的剂量饲以含兴化香葱干粉的高脂饲料40天,试验组动物的血清总胆固醇（TC）水平比高脂模型组降低了56.18%,效果非常显著（P〈0.01）,同时也显著低于阳性对照血脂康组（P〈0.01）。肝重系数较高脂模型组亦有明显下降（P〈0.05）,组织切片镜检可见肝脂肪变性程度减轻。以上结果提示,兴化香葱具有较强的降低血清胆固醇水平和减轻肝脏脂肪化程度的作用。     

四翅滨藜AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析

脱水素（dehydrin,DHN）是一类胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）,在植物脱水条件下能保护细胞内蛋白质和膜结构免受破坏。本研究中,从四翅滨藜（Atriplex canescens）cDNA文库克隆得到逆境胁迫相关蛋白基因AcDHN的全长cDNA（登录号：JN974246）,并进行序列分析。将4cD鼢别插入到原核表达载体pET28a和双元表达载体pYES-DEST52中,通过转化大肠杆菌和酿酒酵母进行原核表达分析和真核表达分析。结果表明：AcDHN序列全长为1408bp,完整的开放阅读框长为1017bp,由338个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子量为38.3kDa,理论等电点为6．47,AcDHN与仙人掌中DHN蛋白同源性为55％。AcDHN基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约45．2kDa的融合蛋白。重组酵母菌株能表现出艮好抗逆性,特别是对NaCl、低温、Na2CO3和NaHCO3胁迫的抗逆性,其中抗碱胁迫能力表现最强。     

Modesto株副鸡禽杆菌血凝素的原核表达及其生物活性鉴定

目的：克隆并原核表达Modesto株C型副鸡禽杆菌（Apg）的血凝素（HA）基因,鉴定该重组HA的生物学活性。方法：根据GenBank上已发表的Modesto株Apg的HA基因序列,设计合成了1对特异性引物,克隆ApgHA基因;以Modesto株Apg中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增ApgHA全长基因（1026bp）,将其克隆到pET-32a（＋）载体上,构建原核表达载体pET—HA,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化重组HA;通过Western印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定该重组蛋白的生物学活性。结果：表达并纯化了Apg重组HA,该蛋白可以和C型Apg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。结论：构建了Modesto株ApgHA基因的原核表达载体,并表达纯化了ApgHA融合蛋白,该重组HA具有凝集鸡红细胞的活性,为进一步研究ApgHA的免疫功能奠定了基础。     

甜菜夜蛾在四种寄主植物上的生命表参数比较研究

在控制条件下对甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)在白菜、大葱、甘蓝和豇豆上的生命表参数进行了比较研究。结果表明,甜菜夜蛾幼虫在4种寄主植物上均为5个龄期。幼虫和蛹在大葱上的发育历期最长,在白菜上最短。甘蓝叶片饲养的甜菜夜蛾生殖力最高,单雌产卵量为1015.8粒,豇豆叶片上饲养的生殖力最低,为496.1粒。甜菜夜蛾在甘蓝上的内禀增长率和净增殖率最高,分别为0.237和287.82,在大葱上最低,分别为0.172和173.90。在大葱上甜菜夜蛾幼虫存活率较低,在其他3种寄主植物上较高。甜菜夜蛾的特定年龄生殖率在甘蓝叶片上最高,第22天单雌产卵量高达453.6粒。研究结果表明,在选取的4种植物中,甘蓝是甜菜夜蛾的最适寄主。     

Akt基因转染对骨髓间充质干细胞缺氧时凋亡和增殖的影响

目的采用Akt基因转染鼠骨髓MSCs探讨Akt基因是否减轻MSCs缺氧时的凋亡和提高缺氧时的增殖能力,即耐缺氧能力。方法将转染和未转染Akt基因的MSCs置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育不同时间（常氧、缺氧0.5h、1h、2h、4h和8h）后,Annexin V/PI双染法行流式细胞仪分析凋亡率（apoptoticrate,AR）和死亡率（deadrate,DR）、MTT法分析细胞增殖状态、Rt-PCR和Western blot等检测Akt和p-Akt表达以及放射同位素法检测MSCs对氚标-葡萄糖（^3H-G）的摄取等。结果1.Akt基因显著降低MSCs缺氧时AR和DR（P〈0.01）,而各缺氧时间点没有统计学意义（P〉0.05）;2.Akt基因显著增高MSCs常氧和缺氧（与未转染Akt基因MSCs同等条件下比较）时增殖能力（P〈0.01）,缺氧时增殖能力显著低于常氧时（P〈0.01）;3.Akt基因显著增高常氧时MSCsAkt mRNA（P〈0.01）和蛋白（P〈0.01）表达,而不增高p-Akt蛋白（P〉0.05）表达;Akt基因显著提高缺氧时p-Akt蛋白（P〈0.01）表达,而不提高常氧时p-Akt蛋白（P〉0.05）表达;4.Akt基因显著增高MSCs常氧和缺氧（与未转染Akt基因MSCs同等条件下比较）时^3H-G的摄取（P〈0.01）,缺氧时^3H-G的摄取显著性低于常氧培养时（P〈0.01）;^3H-G的摄取与细胞增殖显著正相关（r=0.79,P=0.015）而与细胞凋亡显著负相关（r=-1.47,P=0.023）。结论Akt基因转染可显著提高MSCs耐缺氧能力,此可能与缺氧时改善MSCs葡萄糖摄取等有关。