Ti质粒基因在单子叶植物中的表达

<正> 根癌农杆菌感染双子叶植物时,能侵入双子叶植物的细胞壁,并通过一种未知机制将其Ti质粒DNA导入植物细胞内。导入的Ti质粒DNA(T-DNA)能整合到植物细胞的核基因组中,并被转录。通过遗传操作插入Ti质粒T区的任何DNA片段似乎都能随根癌农杆菌一起转移到植物细胞内。因此,根癌农杆菌作为载体,已广泛用于高等植物外源遗传物质的导入研究。它最终有可能给作物的基因组加入一些有益的遗传成分。遗憾的是,把Ti质粒用作转     

植物基因载体—Ti质粒的应用方法<下>

根癌农杆菌使许多双子叶植物产生冠瘿瘤是其Ti质粒的T区DNA转入植物细胞的结果,Ti质粒是天然的植物基因载体。为克服直接操作Ti质粒的困难,人们构建了中间载体,将嵌合基因插入中间载体构成表达载体。改建的Ti质粒——pGV 3850等系统,是缺失了致瘤基因,但保持转化植物细胞的能力的Ti质粒。双质粒系统,SEV系统则是进一步完善化的Ti质粒载体。另外我们还讨论了构建其它基因载体,开辟多种转化途径的必要性。     

华盛顿大学等开发抗CMV、AIMV、PVX的重组植物

美国华盛顿大学(密苏里州圣路易丝)生物学部的Roger.N.Beachy与孟山都公司共同导入植物病毒的外壳蛋白基因,分别成功地培育出抗病毒的植物。该小组已用这种方法培育出抗烟草花叶病毒(TMV)的烟草、番茄。其中番茄已开始了野外试验。这次把应用范围扩大到TMV以外,所以这种方法应用范围很广,而且实验证明能应用于抗病毒,病害的     

植物的光调节基因在受体细胞中的表达-植物遗传工程的一个新进展

在植物分子遗传学和遗传工程研究中,根癌农杆菌的Ti质粒是个重要的载体。实验已经证明,它可将外源的功能基因插入到植物细胞并整合到植物细胞核的基因组中。在某些情况下,这些细胞再生成植株,而插入的基因可以通过减数分裂转给种子遗传下来。     

植物基因工程进展

70年代末,科学家通过分子生物学的研究证实,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染了双子叶植物之后,能把它的质粒(Tumor inducing plasmid,简称Ti质粒)上的一段DNA(Transfer DNA,简称 T-DNA)插入到植物染色体中,使植物产生冠瘿瘤(crown gall),T-DNA在冠瘿瘤细胞内能稳定     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

Biosource公司用植物生产疫苗获得成功

Biosource Technologies公司和马里兰州贝塞斯达纳瓦尔医学研究所的研究人员协作研究,获得了位于重组烟草花叶烟草花叶病毒组(TMV)表面的疟疾表位。他们用遗传工程方法,使疟疾序列在TMV外壳蛋白内表达。将筛选的B-细胞疟疾表位插入TMV外壳蛋白表面环状区或与其C-末端融合。用任意一种形式的这种修饰过的病毒侵染烟草植株时,都产生高浓度外壳蛋白。Thomas Turpen及其同事认为,重组植物病毒有可能满足大规模及有经济效益地生产亚基疫苗(易于贮藏及管理)的需要。一般情况     

农杆菌接种法作为一种简便的植物病毒载体的侵染方法

烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体,但用其生产外源蛋白时,必须先将它体外转录成RNA,才能被用来接种宿主植物。由于RNA体外转录费用昂贵、操作复杂,因此限制了30B表达载体的进一步应用。针对这一不足,我们用农杆菌接种法(agroinoculation)接种该病毒载体,即将30B cDNA置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和终止子之间,再将整个表达框架插入到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内,构建成质粒p35S-30B,将转入该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中,30B cDNA随T-DNA进入植物细胞后,被转录成可自我复制的RNA形式,进而发生系统侵染。为了检测此接种方式的可行性,绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中,构建成p35s-30B：：GFP,用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。证实该病毒载体可通过简便的农杆菌接种法侵染Nicotiana benthamiana,在被接种植物的系统叶中,GFP的表达量可占植物总可溶蛋白的5．2％。     

植物生物技术的现状及展望

1　大田转基因植物研究现状1.1　病原体诱导的病毒抗性自从Beachy等发现转基因植物表达烟草花叶病毒外壳蛋白基因可以抑制或延缓病毒病的发生之后 ,又发现许多病毒序列可以产生一定水平的抗病性。病原体诱导的病毒抗性 (PDR)基因包括一些非编码蛋白序列 (如缺陷干扰型RNAs和DNA     

T—DNA转移机理

根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）作、一种革兰氏阴性的土壤杆菌,于1907年发现它是植物致瘤的起因。植物细胞被侵染后,形成冠瘪瘪（crowngall）,冠＆瘤细胞可产生正常细胞所不能产生的冠瘦群（。Pines）,被农杆菌利用作为碳源和氨源。农杆菌侵染后从植物肿瘤细胞中摄取营养的边种现象,被称为“遗传寄生”（seneticcolonisatton）o经过持续不断的基础研究,直到1974年,发现在农杆菌中有一种环形的Ti质粒fie200kb）,Ti质粒上的一段T－DNA（Tra——fer［＞NA）可以插入植物基因组,引起细胞特性补文化、从此,人们试图利用…     

国外科技简讯

利用植物生产疫苗 据 AgBiotech News and In-formation 1995年3月报道:美国加利福尼亚州生物资源技术公司和美国马里兰州海军医学研究所的科学家构建了重组烟草花叶病毒(TMV)表面上的疟疾表位(抗原决定簇)。他们通过生物工程把疟疾序列表达于TMV衣壳蛋白。选择B细胞疟疾表位或是被插入 TMV衣壳蛋白的环区,或是被融合于其C末端。用上述任何一种形式的修饰病毒感染烟草植株,都可产生大量的衣壳蛋白。重组植物病毒有可能满足亚单位疫苗生产的需要。这种植物疫苗不仅生产成本低廉,而且可在室温下贮存。一个植株所生     

植物基因工程的克隆载体(续)

4.Ti质粒的改建 我们在前面的有关部分中已经谈过,Ti质粒能够感染大量的双子叶被子植物,具有相当广泛的寄主范围。同时在它的感染过程中,可以将T-DNA区段转移给寄主植物细胞并整合到核染色体的基因组上,最后实现基因的功能表达。所以说Ti质粒是植物基因工程的一种天然的载体。     

Bac-to-Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用

利用Bac-to-Bac系统,在大肠细菌中复制增殖杆状病毒质粒bacmid,并通过RecA介导法、ET-recombination法在bacmid DNA上缺失或插入功能基因,构建功能基因缺陷型或补回型的杆状病毒质粒.该质粒转染到昆虫细胞中产生重组病毒,进而在细胞甚至虫体水平上研究基因的功能,极大改善了传统上用空斑实验筛选重组病毒的不足.     

哺乳动物基因能使植物抗镉

从该会议上还获悉一些植物经遗传操作后能使它们对镉产生抗性。加拿大农业公司的Daniel D.Lefebvre 和 Jean Francois Laliberté用编码中国仓鼠中金属硫因Ⅱ的 DNA 转化了一些植物。镉对一些植物是一种严重污染物。它能改变固氮过程,减少植物中水和养分的转移,因而抑制光合作用。加拿大的一些研究人员将一种 DNA 片段(200个碱基对长),包括编码中国仓鼠卵巢细胞中的金属硫因的基因,插入到花椰菜花叶病毒衍生的一种质粒中。然后用一些     

用土壤杆菌(Agrobacterium)Ti质粒转化单子叶植物

<正> 迄今,植物直接遗传操作方面所取得的进展主要在双子叶植物,而单子叶植物包括主要的谷类作物尚不是容易进行遗传工程的对象。然而,最近的两篇论文发表后,看来,单子叶植物有可能在某一天同样会成为遗传工程的研究课题。利用Ti质粒和Ri质粒尤其是土壤杆菌的Ti质粒可以将外来基因插入对土壤杆菌易感的     

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。     

Ri质粒基因转化植物细胞的机理

发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)含有一个约250Kb的大质粒,与Ti质粒转化植物细胞产生冠瘿瘤(crowngall)相似,它也可以侵染双子叶植物受伤部位的细胞并产生大量不定根(所谓发根或毛状根,(hairyroot),因此,这个大质粒被称为Ri质粒(根诱导质粒,Root-inducingplasmid)。     

含HIV-1 gag、gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究

将HIV－1中国株42（B亚型）gag基因及gag与gp120 V3区的嵌合基因gag V3插入腺病毒伴随病毒（AAV）表达载体（pSNAV）质粒中,构建重组质粒pSNAV-gag及pSNAV-gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞,G418筛选得到转入重组质粒并能表达外源基因的细胞系,命名为BHK－gag及BHK－gagV3。用具有重组腺病毒伴随病毒（rAAV）包装功能的一种重组单纯疱疹病毒（rHSV）分析感染这两株细胞系,纯化后得到rAAV,电镜观察可见到大量实心病毒颗粒,核酸杂交检测重组病毒滴度达到10^12病毒颗粒／ml,重组病毒感染293细胞,ELISA检测有gag及gagV3基因的表达。用重组病毒免疫Balb/C小鼠,检测抗体及细胞免疫水平,证明重组病毒可以在小鼠体内诱导产生细胞及体液免疫。     

人肾脏相关基因Nox4过表达慢病毒载体的构建与定位检测

目的:克隆Nox4基因入pLenti6.3慢病毒表达载体,为探索Nox4基因在ROS产生中的作用提供实验基础。方法:根据NCBI人Nox4 mRNA序列设计引物,再利用酶切连接反应将Nox4插入到入门载体pENTR3C中,成功构建pENTR3C-Nox4后,通过LR反应,将Nox4和EGFP tag插入到慢病毒表达载体pLenti6.3中,经酶切和测序验证正确后,将重组表达质粒转染入人Hela细胞,通过Western-Blot验证Nox4的表达情况,免疫荧光验证Nox4在细胞内的定位情况。结果:入门载体及表达质粒测序比对完全正确,转染Hela细胞后可见明显的表达条带,并且主要定位于细胞器内质网中。结论:成功构建了带有EGFP tag的Nox4基因慢病毒重组表达载体,转染Hela细胞后,其能正确表达并定位于内质网中,为研究Nox4在调节ROS产生中的作用奠定了基础。     

用毒蛋白控制植物病毒病害的基因工程设想

本文提出利用抑制植物蛋白质合成的毒蛋白基因读码框和植物病毒亚基因组启动子组成嵌合基因,预先在植物中表达负链RNA,在病毒侵染细胞中变为正链毒蛋白RNA,产生毒蛋白,迅速中止该细胞蛋白质合成,从而达到完全控制植物病毒病的植物基因工程工程设想。白喉毒素A链基因读码框是一种对多种植物有用的适合于本设想的毒蛋白基因读码框。烟草中负链毒蛋白RNA不会自动变为正链RNA。TMV外壳蛋白亚基因组是按BMV RNA_4的方式生成;它的启动子可以用作TMV的启动开关,使植物细胞中白喉毒素A链负链RNA特异地转变为毒蛋白mRNA。