重组痘苗病毒表达乙肝核心抗原基因的研究

pMM2066质粒EcoR I酶切回收ATG前只有12bp的乙肝核心抗原基因片段,将此基因片段插入痘苗转移载体pGJP-5的P7．5启动子后,组建成P5-C2066质粒,通过细胞内同源重组技术,于BudR存在条件下用人TK-143细胞筛选出三株能表达HBcAg的重组痘苗病毒株。感染细胞上清液1：64稀释时仍能用ELISA法测到HBcAg活性,同时也能测到滴度相近的HBeAg活性。免疫电镜可见平均为26．6nm的HBcAg颗粒。进行了不同量的重组痘苗病毒感染不同细胞,和不同培养温度对HBcAg表达影响的观察。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

共表达内质网响应蛋白HAC1对α-半乳糖苷酶在毕氏酵母中表达的影响

为提高毕氏酵母(Pichia pastoris)中重组α-半乳糖苷酶的表达,将来源于P.pastoris GS115的hac1基因构建至pPIC9K表达载体中,转化到重组P.pastoris中与α-半乳糖苷酶共表达。研究结果表明,在AOX1启动子控制下,HAC1过表达提高了重组P.pastoris中α-半乳糖苷酶蛋白表达含量,使α-半乳糖苷酶活性提高了2.2倍。经PCR产物鉴定,结果表明重组P.pastoris基因组中插入hac1基因。经50 L发酵罐甲醇诱导168 h,Gal-HAC1-4#工程菌最终酶活达到6 560 U/mL,比Gal-21#工程菌提高了27%。甲醇诱导后Gal-HAC1-4#发酵液中粗蛋白浓度均高于Gal-21#工程菌。表明共表达HAC1蛋白可提高毕氏酵母产α-半乳糖苷酶蛋白的能力。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA 片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac 插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~r Tc~s lac~ 转化体,得到另一个lac 重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac 控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac 的表达作了分析。     

大肠杆菌启动基因的重组和表达 Ⅰ.不同启动基因对β-半乳糖苷酶结构基因表达的影响

质粒pKL6带有β-半乳糖苷酶结构基因(lacZ),启动基因突变失活,lacZ不能表达。在lacZ前插入外源DNA片段,观察lacZ的表达,可以研究启动基因的功能作用。我们用大肠杆菌染色体DNA的HindⅢ片段与pKL6重组,获得一批重组体,对这些重组体的β-半乳糖苷酶的活力水平和限制性图谱作了分析,对它们用作表达载体的可能性进行了讨论。     

核糖体结合位点序列对大肠杆菌中HBcAg重组质粒表达的影响

用Bal-31外切酶调整乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因非编码区长度并克隆到质粒pKK 223-3中,获得了不同水平地表达HBcAg的重组质粒pKL系统。该系统所表达的HBcAg蛋白分子量为21000D。DNA序列分析发现高、中、低表达水平的3个重组质粒的SD序列到HBcAg基因的ATG之间的距离分别为12bp、13bp和19bp,高、低表达质粒的mRNA核糖体结合位点序列的二级结构分析显示,二者的自由能相差约3倍,且低表达质粒的mRNA的SD序列中的3个碱基及AUG中的3个碱基都参与配对,而高表达质粒只有SD序列中的2个碱基参与配对,表明SD序列到ATG的距离及mRNA的二级结构均在HBcAg的表达调控中起重要作用。     

假单胞菌M18转录调节因子σs基因与无启动子lacZ基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacZ)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

预防仔猪腹泻无抗性基因工程菌株的构建

以原来含热不稳定肠毒素B亚单位基因质粒DNA为载体,插入lacZ基因,构建了一个既能表达LT-B亚单位又能表达B-半乳糖苷酶的含四环索抗性基因的重组体。在该重组DNA的四环素抗性基因内再插入K 88粘附因子抗原基因,从而灭活了四环素抗性基因。经测定该重组体能表达LT－B和K88两种抗原,lacZ基因取代四环素抗性基因,成为良好筛选标记。所构建的重组质粒能稳定存在。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)用于乙型肝炎的诊断是十分必需的,但从尸肝中提取可用于诊断的HBcAg十分困难。为了获得大量廉价的HBcAg用于临床诊断和流行病学检测,我们将HBcAg基因进行了重组,并在原核细胞中得到满意表达。 首先将带有完正ayw亚型乙型肝炎病毒DNA的pHBV-1质粒DNA(梁伟才惠赠,7.5kb)切下1504bp的BamHI片段,后者含有完整的HBcAg基因。将它插入pUR222的Bam     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

HBcAg表达菌株的筛选、初步鉴定与DNA顺序分析

为提高HBcAg(乙型肝炎核心抗原)在大肠杆菌体内表达水平,将有HBcAg的基因片段用核酸外切酶从两端消化,插入载体质粒pUR222的EcoRI酶切位点,转化Ecoli BMH71—18,用菌落原位酶联免疫法由275个转化子筛选到7株阳性克隆,用ELISA比较了它们的表达水平,表达水平最高者为M2066菌株,P/N=2.0时菌体裂解液的稀泽度为1:33000’比表达最低者M2098高8,000倍,比第一代菌株M206高15,000倍,DNA顺序分析结果表明与mRNA起始密码上游的发卡结构去除有关。用SDS-PAGE和聚乙烯簿膜复印法检测菌体裂解液中HBcAg的分子量为21000,42000及63000,呈单体和聚合物形式存在,比由病人肝脏和血液中提取的HBcAg(19000)分子量大,为融合蛋白。经琼脂免疫双扩散与ELISA阻断试验未发现与β半乳糖苷酶有免疫学交叉反应。用ELIDA法,M2066-HBcAg与肝-HBcAg同时检测40份血清标本的抗-HBc,二者符合率95％。     

乙肝病毒核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

根据乙型肝炎病毒(HBV)DNA全基因组克隆pHBV-NC的酶切图谱,分别用限制性内切酶HincⅡ-AvaⅠ和BgLⅡ剪切pHBV—NC_1-DNA,获得了两种不同长度HBV核心抗原基因片段:HBcAgⅠ片段和HBcAgⅡ片段。用带有P_R启动子的质粒pCQV2和带有Lac启动子的质粒pUR222与HBcAgⅠ段和HBcAgⅡ片段连接,分别转化到大肠杆菌中,获得了三种不同的表达菌株,命名为pHBcAgⅠ、pHBcAgⅡ和pLcAgⅡ,并对其核心抗原的表达量做了比较。     

通过乙型肝炎病毒核心基因5''''端的修饰使核心抗原在大肠杆菌中高效表达

为了使乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)在大肠杆菌中获得高效表达,本文首次采用一种新方法对核心基因前区进行改造与修饰,即用限制性内切酶Taq I从核心基因内部5′端切开,去除核心基因起始信号ATG及ATG 5′端上游的全部前核心区(Precore),再化学合成一段既包含核心基因起始信号又具有多种功能的DNA片段。将两者拼接重组到表达载体pUC9上,转化受体菌,成功地获得高效表达HBcAg的菌株。用ELISA法检测,表达滴度为1:80000。表达产量占菌体总蛋白的16％。其菌体裂解液经免疫电镜观察,可见到成堆聚集的典型HBcAg颗粒。抗原单体分子量约为22000道尔顿,双体为44000。与目前国内外所普遍采用的方法比较,本文的方法有许多明显的优点,可用于其它基因改造。     

在大肠杆菌中反义RNA抑制乙型肝炎病毒核心抗原的表达

将乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的DNA序列分别按正、反方向置tac启动子的控制下,并克隆进入同一个质粒中,转化大肠杆菌JM103后,观察到HBcAg和HBeAg的合成均明显低于仅含有HBcAg基因的细菌,最大抑制率可达70％～80％,分子杂交可见反义RNA存在。     

大肠杆菌合成的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)转化为e抗原(HBeAg)的探索

本文以带有HBcAg基因重组质粒的大肠杆菌转化株Ecoli MM206所合成的HBcAg进行HBcAg转化为HBeAg的探索研究。菌经超声破碎获得的菌裂解液对生理盐水透析两天后,酶联检测发现抗原性部分转化为HBeAg。将菌裂解液或HBcAg精制品用2-巯基乙醇处理,可使抗原性发生进一步转化。但是分子筛层析证明抗原蛋白分子大小没有明显变化。这种制品有可能作为诊断试剂用以检测抗-HBe,而且实验结果表明HBeAg是由HBeAg衍变来的。为要提高HBeAg的稳定性,以碘乙酰胺处理,使还原的抗原蛋白通过羧甲基化反应封闭游离的巯基。经上述处理的HBeAg通过分子筛层析可与大部分细菌杂蛋白分开,制品只有HBeAg活性而测不到HBeAg活性,因而提高了抗原蛋白的稳定性与纯度。     

含不同长度前C序列的乙型肝炎病毒核心抗原基因在重组痘苗病毒中的表达

核酸序列分析表明,乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原基因(C基因)编码区内存在两个ATG。目前认为第二个ATG为乙肝病毒C抗原的起始密码子,两个ATG之间的序列称为前C序列,共87bp。Uy、Rutter、Roossinck及景新等的研究表明,含前C序列时,C基因在大肠杆菌中的表达是形成具有HBeAg活性的P25~e膜蛋白,在哺乳动物细胞中的表达则是形成分泌性的HBeAg;不含前C序列时,在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均形成P21~e     

Rearrangement of the surface antigen gene of hepatitis B virus integrated in the human hepatoma cell lines.

The rearrangement of integrated HBV DNA sequences in three different hepatoma cell lines, huH-1, huH-2, KG-55-T from Japanese patients, were studied by blot hybridization using whole HBV genome or a HBsAg or HBcAg DNA as a probe. The characteristic existence of multiple integration sites of HBV DNA sequences in each HindIII-restricted hepatoma cell DNA was revealed by the HBV genome probe. Detection of the isolated HBsAg gene in the HindIII fragment indicates that the integration of HBV DNA was not always related to the maintenance of the whole viral genome, and that movement of the HBsAg gene to another location occurred by rearrangement. On the other hand, the presence of the HBV DNA sequence without the intact HBcAg gene was shown in some of the HindIII fragments, when the HBcAg gene, probe was used, but a HindIII fragment, containing only the HBcAg gene, was not detected so far. The absence of the intact HBcAg gene suggests that the viral genome may lose a part of the HBcAg gene in the process of integration. This is consistent with recent findings of Ogston et al. (1982) that in Woodchuck hepatocellular carcinoma viral sequences are extensively rearranged.     

乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇（HBVPreS2epitope）与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇。我们将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因与ＨＢｃＡｇ基因不同位点进行融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并对融合蛋白进行了纯化。经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验表明,融合蛋白具有ＰｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ两者的抗原性。此外,研究还表明,强启动子能使表达水平有一定提高。