肺炎支原体双蛋白多抗原表位表达载体的构建

目的构建肺炎支原体(Mp)双蛋白多特异抗原表位表达载体,提高重组蛋白抗原的敏感性。方法应用生物信息学方法筛选Mp P116粘附蛋白抗原表位序列,PCR点突变技术获取P116蛋白基因片段,与pMD-T载体重组,转入大肠埃希菌JM109,通过限制性酶切图谱和基因序列分析鉴定重组质粒。酶切回收P116基因片段与pGEX 6P-1-P1 DNA重组,转入大肠埃希菌JM109菌株。用Glutathione Sepharose 4B纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析表达产物的相对分子量,用Mp免疫血清进行免疫印迹试验,鉴定重组蛋白的免疫原性。结果 PCR点突变扩增Mp黏附蛋白P116的基因片段为597 bp,该基因片段与已知的基因库序列分析比较,除两个突变位点由UAG突变为UGG外,其余核苷酸序列同源性为100%。SDS-PAGE分析多表位重组蛋白相对分子质量(Mr)为77.8 kDa。免疫印迹结果显示,Mp兔多价血清能与纯化的78KDa的重组蛋白发生免疫反应。结论本研究成功构建了Mp双蛋白多表位的表达载体。该表达载体表达的重组蛋白具有Mp特异的免疫反应性。重组蛋白的敏感性有待进一步鉴定。     

疟疾多抗原表位基因表达载体的构建及其在烟草中的表达

本文首次报道疟疾多表位抗原基因在转基因烟草中表达成功。疟 疾是当今最需要研究有效疫苗的主要染病之一。过去的研究表明,ＡＷＴＥ基因编码的疟 疾多种怕表位是有铲的抗疟表位,ＣＴＢ基因编码的乱毒素Ｂ亚基是一种既能引起细胞免疫又能引起体液免疫的免疫载体和佐剂。本研究把ＡＷＴＥ－ＣＴＢ融合基因构建到植物表达载体ｐＢＶＧ－ｎｙｌ上,采用共转化的方法,通过基因枪导入转化烟草,经ＰＣＲ扩增ＡＷＴＥ－ＣＴＢ基因片段     

恶性疟原虫多抗原表位基因的融合与表达

本研究以霍乱毒素B亚基(CT-B)基因为载体,构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB/ATE和CTB/AWTE。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外,还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位;后者在此基础上将我国发现的B细胞表位NKNDD基因经8次串联后融合其中、两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌TK1046中,产量分别为10mg/L及5mg/L。表达产物CTB/AWTE经亲和层析纯化的双抗夹心ELISA测定表明,该融合蛋白在保留了与抗CTB抗体结合的同时,与抗NKNDD单抗的结合效价达1∶8000。     

恶性疟原虫多抗原表位基因的融合与表达

以霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因为载体,构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因ＣＴＢ／ＡＴＥ和ＣＴＢ／ＡＷＴＥ。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因ＳＰｆ６６外,还含有很强的Ｔ辅助细胞表位ＣＳＴ３和Ｔｃ细胞表位;后者在此基础上将我国发现的Ｂ细胞表位ＮＫＮＤＤ基因经８次串联后融合其中。两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌ＴＫ１０４６中,产量分别为１０ｍｇ／Ｌ及５ｍｇ／Ｌ。表达产物ＣＴＢ／ＡＷＴＥ经亲和层析纯化双抗夹心ＥＬＩＳＡ测定表明,该融合蛋白在保留了与抗ＣＴＢ抗体结合的同时,与抗ＮＫＮＤＤ单抗的结合效价达１：８０００。     

鸡IL-2/NDV-F蛋白抗原表位融合基因的表达及免疫性初探

研究鸡白细胞介素-2(chicken interleukin-2,ChIL-2)的免疫佐剂功能,构建ChIL-2与新城疫病毒F蛋白多抗原表位(NDV-F)的嵌合基因,以对鸡新城疫疫病进行防治。采用重叠延伸PCR方法通过基因柔性接头将ChIL-2基因和NDV-F多抗原表位基因构建成ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因并克隆入PET-32a载体,经测序鉴定后,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His融合蛋白,Ni2~+亲和柱纯化,表达产物经SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA检测和鉴定。结果表明,实验成功构建并克隆了ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因,嵌合基因在大肠杆菌中表达的ChIL-2-linker-NDV-F融合蛋白分子量约为48kD,表达量约占菌体蛋白总量的45%,纯化后的ChIL-2-linker-NDV-F融合蛋白能与感染NDV的鸡血清发生反应。上述结果证明ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有较强的特异性和免疫原性。     

恶性疟原虫多抗原表位基因表达载体的构建及其在大豆幼胚中的表达

疟疾是当今最需要研究有效疫苗的主要传染病之一。AWTE基因编码恶性疟原虫多种抗原表位基因 ,CTB基因编码霍乱毒素 B亚基 ,是一种既能引起细胞免疫又能引起体液免疫的免疫载体和佐剂。把 AWTE- CTB融合基因构建到植物表达载体 p BVG- ny2上 ,通过基因枪导入法 ,转化大豆幼胚分生组织。 X- glu染色检测到 GUS基因的表达 ;抗原性分析实验结果表明 ,特异表达的融合蛋白可与 CTB和 AWTE抗体结合 ,具有 CTB抗原性。这个实验结果 ,表明疟疾多抗原表位基因首次在转基因大豆幼胚中得到瞬时表达     

A、O型FMDVT／B细胞抗原表位融合基因合成及植物表达载体构建

人工合成A、O型FMDV的7个细胞表位基因,应用套叠PCR将其中5个T细胞表位基因融合为T,2个B细胞表位基因融合为B,分别克隆进pMD-18T载体,再利用同尾酶的酶切及连接构建了不同组合的克隆载体(pMD-BT/BTT),然后将克隆载体改造为中间载体(pMD-xsB/xsT/xsBT/xsBTT),最终获得4个重组植物表达载体(pBI-xsB/xsT/xsBT/xsBTT).这为进行热研2号柱花草遗传转化及进一步研究同型与异型FMDV之间多表住基因的不同融合方式的免疫效果奠定了基础.为口蹄疫可饲植物疫苗的应用研究提供借鉴.     

A、O型口蹄疫T/B细胞多抗原表位融合基因植物表达载体的构建

通过对(pMD-xsB/xsT/xsBT/xsBTT)4个克隆载体进行PCR,在(xsB/xsT/xsBT/xsBTT)目的基因前接入引导肽序列(用Y表示),克隆中间载体(pM D-xsY B/xsYT/xsYBT/xsYBTT),再利用同尾酶的酶切及连接得到4个重组植物表达载体(pBI-xsYB/xsYT/xsYBT/xsYBTT).经限制性酶切鉴定和测序分析证实表达载体构建正确,为下一步热研2号柱花草转基因植株的获得奠定了基础.     

恶性疟原虫杂合多肽抗原融合基因的克隆和表达

合成了５对寡核苷酸片段，分别连接在两种恶性疟原虫杂合多肽（４５肽和５８肽）抗原基因片段（ＨＰＦＧＡ和ＨＰＦＧＢ）的头部和尾部，将这两种片段分别与霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴ－Ｂ）基因末端融合。两种杂合多肽抗原分别含有数个红内期和红外期有代表性的、并能被Ｔ或Ｂ淋巴细胞识别的保护性抗原表位，ＣＴ－Ｂ基因前端具有促使分泌的信号肽序列，将这两种融合基因的不同重组质粒分别转化大肠杆菌，对转化菌的培养上清检测表明融     

恶性疟原虫杂合多肽抗原融合基因的克隆和表达

合成了５对寡核苷酸片段,分别连接在两种恶性疟原虫杂合多肽（４５肽和５８肽）抗原基因片段（ＨＰＦＧＡ和ＨＰＦＧＢ）的头部和尾部,将这两种片段分别与霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴ－Ｂ）基因末端融合。两种杂合多肽抗原分别含有数个红内期和红外期有代表性的、并能被Ｔ或Ｂ淋巴细胞识别的保护性抗原表位,ＣＴ－Ｂ基因前端具有促使分泌的信号肽序列。将这两种融合基因的不同重组质粒分别转化大肠杆菌,对转化菌的培养上清检测表明融合蛋白被分泌性表达,既具有恶性疟原虫和ＣＴ－Ｂ抗原性,又保持了ＣＴ－Ｂ与其受体神经节苷脂ＣＭ１结合的生物学活性。     

乙型肝炎病毒C蛋白基因的克隆表达

根据已知的C蛋白基因序列设计一对引物,用PCR法从HBV adw亚型全基因组克隆中扩增出约500bp的NDA片段,将该基因克隆到表达质粒pQE30中,转化大肠杆菌,进一步对重组质粒中的插入片段进行DNA测序,证明是C基因,阳性克隆子经IPTG诱导后,获得了目的蛋白的表达,菌体经超声破碎后,目的蛋白主要存在于上清中,为下一步研究其抗原性和免疫原性奠定了基础。     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

Cloning and expression analysis of p26 gene in Artemia sinica

The protein p26 is a small heat shock protein that functions as a molecular chaperone to protect embryos by preventing irreversible protein damage during embryonic development. A 542 bp fragment of the p26 gene was cloned and sequenced. The fragment encoded 174 amino acid residues and the amino acid sequence contained the α-crystallin domain. Phylogenetic analysis showed that eight Artemia populations were divided into four major groups. Artemia sinica (YC) belonged to the East Asia bisexual group. Expression of the p26 gene at different developmental stages ofA. sinica was quantified using real-time quantitative polymerase chain reaction followed by cloning and sequencing. The relationship between the quantity of p26 gene expression and embryonic development was analyzed. The results indicated that massive amounts of p26 were expressed during the development of A. sinica. At the developmental stage of 0 h, A. sinica expressed the highest level of p26. As development proceeded, expression levels of the p26 gene reduced significantly. There was a small quantity of p26 gene expression at the developmental stages of 16 h and 24 h. We concluded that p26 might be involved in protecting the embryo from physiological stress during embryonic development.     

人自身抗原SmB'的基因克隆和原核表达

目的:为建立新的自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定人自身抗原SmB'。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从白血病淋巴细胞HL-60细胞株中克隆人自身抗原SmB'全长基因;将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21;阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western印迹。结果:PCR产物长约700bp,与预期的657bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-SmB'重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子质量为51000,具有天然人自身抗原SmB'的免疫原性。结论:克隆表达了人自身抗原SmB',为建立相应的自身抗体检测方法奠定了基础。     

细菌视紫红质的基因克隆与表达

细菌视紫红质的基因克隆与表达卢春林,汪俭,梅祺,韦钰（东南大学吴建雄实验室,南京２１０Ｏ１８）叶寅,田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）关键词细菌视紫红质基因;聚合酶链反应（ＰＣＲ）;基因克隆与表达细菌视紫红质（ｂａｅ快ｒｉｏｒｈｏｄｏＰ...     

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础.用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pET-30a中,转入BL21中表达.经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了1tB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达.ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础.     

酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达

用PCR方法克隆了1．5kb的酿酒母Sacchromyces cerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI,将该片段连接到pUC19载体,通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169 和FF4050,对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1．5kb PCR克隆片段,生长曲线实验证明,带有克隆片段的转化株在含0．5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好;用高效液相色谱（HPLC）结合蒸发散射（ELSD）技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。     

PTD-NPY融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因,克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZαA,构建成重组表达质粒pPICZα-PTD-NPY.PCR和酶切鉴定及测序正确后,经限制性内切酶Sac Ⅰ线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中.阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达.经过120 h的诱导,取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳,表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白,Western blotting实验证实表达产物具有特异性.获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白,为下一步的应用研究提供了物质基础.     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。