利用泌乳乳腺鉴定真核基因表达的研究

为了找到一种新的可用于基因及其表达调控元件鉴定的方法,本试验以蚓激酶(LK)作为目的标志基因,分别构建了在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)和beta-酪蛋白启动子调控下的三种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后,以泌乳期羊乳腺作为支持系统,在处于稳定泌乳阶段分别注射400~800μg重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁,检测纤溶活性。结果显示,蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达,注射后6~9h蚓激酶表达量达到高峰,并可持续至72h以上;不同表达载体间表达量略有变化,但无显著差异。这些结果表明,利用泌乳乳腺组织表达真核蛋白是鉴定真核基因表达快速有效的手段之一。     

乳铁蛋白肽基因的合成及其在动物乳腺中的表达

根据已发表的编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)25个氨基酸的mRNA序列,设计了4条用于合成牛乳铁蛋白肽全基因的引物,用重叠延伸PCR法合成149 bp的牛乳铁蛋白肽基因(包括牛乳铁蛋白信号肽序列、上下游酶切位点和终止密码子),并将此基因克隆到载体pI-B,获得了乳腺特异性表达质粒pI-BL,该质粒经生理盐水稀释后直接注入稳定泌乳期奶山羊和奶牛乳腺组织(注射量为400μg),以琼脂板溶圈法检测奶样抑菌活性。结果显示,注射后3~48 h,奶样有明显抑菌活性,其中3~9 h抑菌活性最高。     

奶牛α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

提取经新城疫病毒诱导培养的奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α干扰素成熟蛋白基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,扩增片段为牛α干扰素成熟蛋白序列,与Genebank上发表的α1干扰素序列同源性为98%。然后将特异性片段连接到含分泌信号肽序列的Pichiapastoris表达载体pPICZαA上,将重组质粒经SacI酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了BoIFN-α在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为23kDa,比其推导结果(20kDa)略大,推测可能是因为表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-α具有较高的干扰素活性,约为4.1×10⁵U/ml,经微量蛋白测量仪测得,其表达量约为80μg/ml,比活为5.1×10⁶U/mg。     

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。     

重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。     

山羊β-casein位点打靶载体在乳腺上皮细胞中的表达研究

以本地山羊基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增出山羊β-casein上游包括启动子,外显子1及部分外显子2的6.1kb的调控序列及下游3.3kb的序列,将来自质粒pCDNA3的neo基因以及来自质粒pNEOZTK-2的tk基因,经克隆重组后构建了本地山羊乳腺特异性定点打靶载体,并在其中克隆人乳铁蛋白mini基因,采用脂质体法转染小鼠乳腺上皮癌化细胞系C127,以进行打靶载体的表达功能检测,双夹心ELISA测得诱导液中乳铁蛋白表达量为0.2μg/mL,Western-blot显示重组蛋白分子量比标准品略小,约为76kD,结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。     

人肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物cDNA克隆和高效表达

利用逆转录 聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,从中国正常人肾小球系膜细胞总RNA中扩增出人纤溶酶原激活物抑制物 (PAI 1 )基因cDNA编码区序列 ,并定向亚克隆至pUC1 9质粒 ,克隆的PAI -1cDNA去除了信号肽核苷酸序列并加入新的起始密码ATG ,编码区序列与文献报道的人内皮细胞PAI -1cDNA序列完全相同 .将PAI -1cDNA定向亚克隆至原核表达质粒 pBV2 2 0 ,构建了重组PAI -1基因表达质粒pBV2 2 0 PAI -1 ,在大肠杆菌中得到了高效表达 ,重组PAI -1蛋白表达占菌体总蛋白 45 % .Westernblotting检测 ,在分子量约为 43.0ku处出现一特异性蛋白质条带 .对形成包涵体的表达产物进行变复性处理及FPLC纯化 ,获得纯度 97%以上的潜伏态重组PAI -1 .经 4mol/L盐酸胍激活后 ,重组PAI- 1具有与天然PAI- 1同样的生物学活性 ,对尿激酶型纤溶酶原激活物 (u- PA)具有显著抑制活性 .     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因真核表达载体的构建及其功能的研究

目的:蛇毒纤维蛋白溶解酶能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原,在心脑血管疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。方法:采用双酶切技术从pMD18T-FLE I克隆载体上获得中介蝮蛇毒纤溶酶基因编码区,再将其亚克隆到真核表达载体pFASTBACHTa上,经转化、筛选和鉴定,获得重组真核表达质粒pFASTBACHTa-FLE。重组质粒经小鼠尾静脉快速注入小鼠体内,进行瞬时表达。结果:经SDS-PAGE和Western blot检测,表明在小鼠肝脏组织中有重组FLE蛋白表达。免疫组织化学检测证明该蛋白在小鼠肝脏组织中大量表达。纤维蛋白平板法鉴定该重组蛋白具有较高的纤溶活性,其活性呈现出剂量相关性和时间依赖性。因此为进一步对中介蝮蛇毒纤溶酶的应用奠定了坚实的基础。     

SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系.方法根据已发表的SV40病毒T基因序列设计引物,以整合有SV40 DNA早期基因区的COS-1细胞基因组DNA为模板,用高保真PCR扩增SV40 T基因.将获得的SV40 T基因克隆入真核表达载体,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞.经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆,对其生物学特性进行研究.结果扩增出序列正确的SV40T基因,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第4天,细胞群体倍增时间为23.5*!h,克隆形成率为26.7%.DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV40 T基因,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长.部分细胞克隆已在体外传30代以上,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征,在胶原基质上能形成腺泡样结构.结论本研究获得的SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性.     

干扰素-tau的原核表达、纯化和活性测定

干扰素-tau (IFN-tau)是一种新发现的I型干扰素,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆IFN-tau cDNA的基础上,PCR扩增出IFN-tau ORF,与原核表达载体pBV220重组后,成功的构建了IFN-tau的原核表达质粒pBV220/IFN-tau。重组质粒转化大肠杆菌BL21,该菌经过诱导,用凝胶过滤色谱层析的方法获得了纯化的目的蛋白,该蛋白经过氨基酸序列分析证实是IFN-tau ;用细胞病变抑制法测定IFN-tau经过透析复性后的活性为2.09×106IU/ml,比活性为2.35×106IU/mg。