TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

NOD1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pflag-NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pflag-NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF-κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。     

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。     

TANK结合激酶1在PINK1/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬中的作用研究进展

线粒体自噬是一种清除受损或多余线粒体的过程,在调节细胞内线粒体质量和维持线粒体能量代谢等方面发挥重要作用。TANK结合激酶1 (TANK-binding kinase 1, TBK1)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,同时参与调控PTEN诱导假定激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬过程。近期研究表明,TBK1可磷酸化视神经蛋白(optineurin, OPTN)、p62/sequestosome-1、Ras相关GTP结合蛋白7 (Ras-related GTP binding protein 7, Rab7)等自噬相关蛋白,并介导核点蛋白52 (nuclear dot protein 52, NDP52)与UNC-51样自噬激活激酶1 (UNC-51 like autophagy activating kinase 1, ULK1)复合物相结合,以及TAX1结合蛋白1 (TAX1-binding protein 1, TAX1BP1)与微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-assoc...     

人1型酪蛋白激酶的真核表达及其在肿瘤细胞中的定位

目的:构建带FLAG标签的人1型酪蛋白激酶(CK1)基因的真核表达载体,获得其表达产物,并研究该激酶在骨肉瘤U2OS、乳腺癌ZR-75-1、肝癌HepG2等多种肿瘤细胞中的表达及定位情况。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增人CK1基因的全长编码区,将其克隆到带FLAG标签的pCMV-Tag2B载体中;将重组质粒转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达情况;细胞免疫荧光观察FLAG-CK1质粒在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞中的细胞定位。结果:双酶切和测序结果显示FLAG-CK1真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果表明,FLAG-CK1转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞后成功表达;细胞免疫荧光实验显示,CK1在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞的胞核和胞质中均有分布,且胞核信号强于胞质。结论:构建了CK1的真核表达载体,且FLAG-CK1能在不同肿瘤细胞系的细胞核和细胞质中表达,为进一步研究CK1对细胞的调控奠定了实验基础。     

TANK结合激酶1在固有免疫应答中的作用及其泛素化调控

固有免疫系统通过模式识别受体识别病原微生物表面的病原相关分子模式启动固有免疫反应,经级联信号转导,激活下游转录因子NF-κB和干扰素调节因子IRFs,进而产生炎性细胞因子以及Ⅰ型干扰素,抵抗病原微生物感染。TANK结合激酶1 (TANK binding kinase 1,TBK1) 作为一个中心节点蛋白,参与多条固有免疫信号通路的传导,可同时激活NF-κB和IRFs,是机体抗感染过程中关键的蛋白激酶。TBK1的精准调控对维持机体免疫稳态、抵抗病原体入侵至关重要。文中综述了TBK1在固有免疫应答中的作用及其泛素化调控机制,以期为病原体感染及自身免疫病的临床治疗提供理论基础。     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

CARP1基因克隆、表达及其泛素连接酶活性的鉴定

目的：克隆并表达caspase-8／10相关RING结构域蛋白1（CARP1）基因,检测其泛素连接酶活性。方法：提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果：免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1（RIP1）被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a（TNFa）引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论：构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

大鼠促甲状腺激素释放激素受体1基因的克隆及其在COS-7细胞系中的表达

目的:克隆大鼠促甲状腺激素释放激素受体1(TRH-R1)基因,构建其真核表达载体,并检测该基因在非洲绿猴肾细胞系COS-7中的表达。方法:应用RT-PCR方法,以大鼠脑源RNA为模板,扩增获得TRH-R1基因,定向克隆到pDsRed2-N1中,以LipofectAMINE 2000试剂转染pDsRed2-N1-TRH-R1表达载体至COS-7细胞系中进行瞬时表达。结果:测序结果表明,从大鼠脑源总RNA中克隆到正确的TRH-R1基因全长编码序列;显微照相观察到所构建的TRH-R1表达载体质粒在COS-7细胞系中获得有效表达。结论:大鼠TRH-R1基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7细胞系中表达获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人sTNFR1基因的克隆、融合表达与生物学活性

采用RT-PCR,从Hela细胞的mRNA中扩增人sTNFR1基因,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,转化入大肠杆菌,测序证实其序列与基因数据库中sTNFR1基因一致。经异丙基-β-D半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达,淀粉树脂亲和层析法纯化,得到融合蛋白sTNFR1-MBP。结果显示：经Western-blotting检测,sTNFR1-MBP具有免疫活性;MTT检测目的蛋白可有效地封闭TNFα对QSG7701的细胞毒性作用;流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用;sTNFR1-MBP具有良好的生物活性,为今后的研究打下了基础。     

人Polo样激酶1基因的克隆表达及其影响c-Abl表达水平功能的初探

目的:克隆并在293细胞中表达人Polo样激酶1(Plk1)基因,探索Plk1对非受体型酪氨酸激酶c-Abl表达水平的影响。方法:利用PCR法扩增Plk1基因,分别定向克隆至pcDNA3-Flag及pCMV-Myc真核表达载体,将上述质粒分别转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达;将上述质粒分别与c-Abl表达质粒共转293细胞,检测带有不同标签的Flag-Plk1或Myc-Plk1对细胞中c-Abl激酶表达的影响。结果:构建了Flag-Plk1和Myc-Plk1真核表达质粒,其在293细胞中均可表达,蛋白的相对分子质量为68×103;与其共转的c-Abl激酶表达水平显著下调。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1和Myc-Plk1蛋白,且初步发现Plk1可以抑制c-Abl的表达。     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

ENC1的克隆,原核表达与数种细胞系表达谱分析

以人 3月胎脑总RNA为模板 ,用RT PCR的方法得到了ENC1(ectoderm neuralcortex 1)基因的cDNA ,经测序证实该cDNA的长度为 180 0bp ,包含ENC1的完整编码区 .将之克隆入pGEX 4T 1载体构建重组表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1表达 ,经Sepharose 4B纯化得到目的蛋白 .通过Northern印迹和RT PCR检验了该基因在数种细胞系中的表达 ,结果表明其在神经胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1中有较高的表达 ,而在包括神经母细胞瘤细胞系SH SY5Y的其他数种细胞系中无表达 .与在正常生理状态下神经系统中两种细胞的表达情况相反 .这种分布不同的情况提示了ENC1在这两种不同来源的肿瘤的发生发展中具有不同作用     

表皮生长因子受体胞外区在哺乳动物细胞HEK293T中的分泌表达和鉴定

目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。