人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体,它能高效表达且有效地分泌表达产物,利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白,融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

Met-Lys-双C肽人胰岛素原基因的构建表达及分离纯化

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 定点突变方法构建编码 Ｍ ｅｔ Ｌｙｓ 双 Ｃ 肽人胰岛素原基因,并在大肠杆菌中以包含体方式获得表达 表达产物经还原、重组、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ 分离纯化,获得 Ｍ ｅｔ Ｌｙｓ 双 Ｃ 肽人胰岛素原,经胰蛋白酶与羧肽酶 Ｂ的酶解, Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔ Ｍ Ｑ 阴离子交换柱层析分离制备得人胰岛素,其放免活性、受体结合活性均与猪胰岛素相同      

人胰岛素原C肽固相合成的改进

利用谷氨酸的γ羧基与 4 甲基二苯甲基胺 (MBHA)树脂的氨基偶联固相 ,合成经HF切割去保护基后形成C端是谷氨酰胺的人胰岛素原C肽。MBHA树脂相对价格便宜 ,此方法是制备人胰岛素原C肽的另一种尝试。同时 ,也用PAM树脂合成了人胰岛素原C肽类似物。     

hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究

旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平.在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段.与表达载体PET-30a连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,收集洗脱峰.对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性.结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%.经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素.Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性.获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料.     

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B—R2—A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式,在Ｅｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原来似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％。经磺酸解,及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白,再经ＣＮＢｒ裂解后,进行还原重组,ＨＰＬＣ分离纯化等步骤,每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５纯化,得重组人胰岛素约２０ｍｇ,基氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性。     

人胰岛素原C肽的合成及专一性抗体制备

利用固相多肽合成中的Boc途径合成了人胰岛素原C肽 ,经TSK柱层析一步纯化 ,产物达HPLC及毛细管电泳均一 ,蛋白质序列分析和质谱分析符合理论值 ,总回收率高达 41 %。为了提高寡肽抗体的专一性 ,我们将丙烯酰化的C肽经催化聚合形成了以聚丙酰为骨架 ,C肽为侧链的聚合体 ,分子量约为 2 5kD。免疫新西兰大白兔 1月 ,获得专一性抗体。用酶联免疫吸附法测得抗血清滴度达 2 .5× 1 0 4 ,与BSA无交叉反应。聚丙酰C肽抗原是制备C肽抗体的一种新的尝试 ,而且也可能成为新的多肽工程疫苗之一 ,为其他传染性疾病多肽疫苗的研究提供新的途径     

含短C肽人胰岛素原类似物DesB30在毕赤酵母中的表达及纯化

合成含短C肽AAK,并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物：HMPIDesB³⁰ (human mini-proinsulin des B³⁰)的cDNA,将其插入大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒pPIC9K．用电转移的方法将重组质粒HMPIDesB³⁰/pPIC9K转入甲醇酵母GS115．用含不同G418浓度的YPD平板筛选高拷贝重组子．经优化条件下的高密度发酵,发酵液用SIPI-40大孔树脂吸附,大孔吸附树脂洗脱液经SP柱进一步纯化后,再用10～20 mmol/L Zn²⁺沉淀,能得到纯度为95%的HMPIDesB³⁰．通过16.5% Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析,表达产物分子质量与理论分子质量相符,经高密度发酵,表达量可达1.0 g/L．纯化回收率可达60%．说明人胰岛素原类似物HMPIDesB³⁰能在甲醇酵母中高效分泌表达,并能通过经济有效的方法纯化．     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素原融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析

构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 21.6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 25%。含CTB-PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB-PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。     

不同调控元件驱动下菊欧氏杆菌纤维素酶celY基因在大肠杆菌中表达的研究

目的:以菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)基因组DNA为模板,通过PCR方法找到了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因及其调控元件并克隆至pUC19载体。为提高纤维素酶celY基因在原核细胞中的分泌表达量,比较了由不同启动子和信号肽调控的celY基因在大肠杆菌中的表达水平。方法:分别构建了由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的多种表达载体与由纤维素酶celY基因自身的启动子和信号肽调控的表达载体相比较。结果:由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的表达载体都不同程度提高了celY基因的分泌表达量。结论:脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽都不失为构建强分泌表达载体的可选元件。     

乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40％,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。     

转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。     

cre基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白活性的检测

Cre重组酶来自噬菌体P1,可以识别特异的loxP位点的DNA序列,并进行专一性的剪切和拼接,利用PCR技术将cre基因克隆至原核表达载体pET-29a,在大肠杆菌BL21（DE3）得到了高效表达,采用DEAE－52柱层析的方法对表达蛋白进行了纯化,体外生物学活性检测表明,表达蛋白对含有同向loxP位点的质粒有切割活性。     

蛙皮素-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与诱导表达

抗菌肽 (Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ)原指昆虫体内经诱导产生的一类分子量在 4ｋＤ左右 ,具有抗菌活性的碱性多肽物质[2 ] 。这类抗菌剂最初是从昆虫、哺乳动物、两栖动物等的防御系统中分离得到的。抗菌肽对革兰氏阳性及阴性细菌、病毒、原虫和发生病变的真核细胞等有杀伤作用 ,具有很强的广谱抑菌作用 ,但对正常哺乳动物细胞无杀伤作用[3 ] 。蛙皮素还具有抗肿瘤活性而没有溶血活性[4 ] ,虽然蜂毒素具有溶血活性 ,但其溶血功能区位于Ｃ端的亲水区域[5] ,两者的极性区域正好相反。据研究表明抗菌肽都会形成两亲螺旋结构的…     

蜂毒溶血肽基因的定点诱变及其在大肠杆菌中的表达

从蜜蜂毒腺中提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的ｃＤＮＡ,再进一步通过定点诱变在蜂毒溶血肽序列前引入了羟胺裂解位点,构建了与β－半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒溶血肽诱变蛋白表达载体,序列分析结果表明,成功地引入了目的密码子且与β－半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框,并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白,为基因工程生产蜂毒溶血肽提供了新途径。     

人工合成人溶菌酶基因在大肠杆菌中表达

利用DNA重组技术生产自然界不能或难以得到的多肽产品用于医药、农业、食品工业等领域,目前在生物领域已有了很大的进展。近年来,科学工作者经体外合成人溶菌酶基因,经克隆、转化,在真核、原核细胞中获得表达^[1-3]。溶菌酶能水解革兰氏阳性菌细胞壁上的β-1,4糖苷键,在内部渗透压的作用下,细胞胀裂开[4,5]。它对有些革兰氏阴性菌,如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌,也有同样作用。因此此酶在食品,特别是在医药上具有重要意义。在这篇文章中,我们报道人工合成人溶酶的克隆和在 温控启动子P_RP_L调控下在大肠杆菌中的表达。