实时无标记细胞分析系统(RTCA)在药物心肌毒性检测和生物活性研究中的应用

实时无标记细胞分析系统(Real time xCELLigence analysis system,RTCA)是一种新型细胞检测技术,能够连续监测、记录及分析细胞活动产生的各种信息,在药物研究中的心肌毒性评估和细胞生物活性考察方面都可以发挥重要作用.文中首先对RTCA的原理与特点进行了介绍,然后分别对RTCA在心肌毒性...     

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的实验研究

目的 制备一种新型的心肌急性缺血再灌注损伤模型,以探讨一种更符合临床实际需求的实验方法.方法 将20只雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分成2组(对照组、实验组),采用结扎主动脉根部引起心肌缺血5min再灌注30 min建立心肌急性缺血再灌注模型;通过应用透射电镜观察心肌细胞超微结构的改变,同时检测心肌组织匀浆丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力.结果 透射电镜下超微结构显示实验组较对照组明显加重了心肌组织结构和线粒体的损害;实验组心肌组织MDA明显高于对照组(P<0.01),而SOD明显低于对照组(P<0.01).结论 本实验成功建立了方法简便、易于操作、取材范围广泛的心肌缺血再灌注损伤模型,为心肌缺血再灌注损伤研究提供了一种更为可行的模型.     

大鼠不同心肌肥厚模型左心室基因表达谱变化的比较

为了解心肌肥厚时基因表达谱的变化规律,本实验复制了三种大鼠心肌肥厚模型：肾上腹主动脉缩窄(suprarenal abdominal aortic stenosis,SRS)、动静脉瘘(arterial-vein fistula,AVF)和去甲。肾上腺素持续静脉输注(jugular vein infusion of norepinephrine,NEi),并应用组织化学方法和超声心动术检测大鼠心脏结构和功能指标,应用cDNA基因芯片技术检测心脏基因表达水平的变化。SRS和NEi引起大鼠向心性心肌肥厚,AVF引起大鼠离心性心肌肥厚,其中NEi大鼠心肌纤维化明显。对不同心肌肥厚模型间大鼠左心室基因表达谱的变化进行两两比较。结果显示,有部分基因在不同模型中表达水平均发生变化,其中多数基因在两种模型中表达水平改变的方向相同,也有少部分基因在两种模型中表达水平改变方向相反。综合比较三种心肌肥厚模型的基因表达谱,各种模型都有特异的基因表达变化,但是有19个基因在三种心肌肥厚模型中表达水平均发生改变。研究结果有可能成为心肌肥厚的标志性基因或治疗靶点,为心肌肥厚发生机制的深入研究提供了新的线索。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中能量代谢变化的研究

本文通过定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,对分化过程中胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞糖酵解能力和线粒体氧化磷酸化能力进行实时定量检测,旨在探索分化过程中细胞能量代谢表型的转换机制.用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt信号通路小分子抑制剂IWP2的方法定向分化人胚胎干细胞为心肌祖细胞和心肌细胞;细胞免疫荧光检测人胚胎干细胞标志物,流式细胞术检测人心肌祖细胞和心肌细胞标志物;应用细胞外流量分析(extracellular flux analysis)方法检测人胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞能量代谢情况.研究发现,人胚胎干细胞干性保持稳定,均表达Nanog、OCT4、SOX2细胞标志物;在向心肌分化过程中,第7 d心肌祖细胞标志物Isl1表达99%以上,分化第14 d心肌细胞标志物cTnT表达83%以上;人胚胎干细胞糖酵解代谢能力最强,心肌细胞线粒体功能最强,心肌祖细胞处于两种代谢方式的过度阶段.因此推断,在人胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中,细胞糖酵解能力逐渐减弱,线粒体氧化磷酸化能力逐渐增强,细胞的能量代谢类型发生转变.本研究旨在优化人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法,揭示...     

Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究

目的：研究Wnt3a在诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化中的作用和原理。方法：设计不同浓度,不同成分的Wnt3a条件培养基对小鼠胚胎干细胞诱导分化,对分化细胞进行形态学鉴定,通过免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白-T（cTnT）的表达,通过RT．PCR检测肌球蛋白重链（ot．MHC）和肌球蛋白轻链（MLC．2v）的表达。结果：Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌样细胞,分化细胞具有自动收缩性,免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白．T（cTllT）表达阳性,RT．PCR检测肌球蛋白重链（d—MHC）和肌球蛋白轻链（MLC-2v）表达阳性。经典Wnt信号途径的抑制剂Frizzled一8／Fc,能够抑制Wnt3a的诱导分化作用。结论：Wnt3a通过经典Wnt信号途径诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

高效建立成年小鼠心肌梗死模型

目的探讨高效建立小鼠心肌梗死模型的方法。方法分别采用右侧卧位及仰卧位两种方法来建立模型,通过观察心电图变化、检测cTNT、病理检测等方法来证明模型成功,并以比较其存活率、手术时间、出血量、肺损伤率等来评价两种方法的高效性。结果结扎后心肌局部变苍白,心电图ST-T段抬高,cTNT呈阳性,心肌纤维化,右侧卧位方法建模小鼠存活率显著提高。结论右侧卧位横切口开胸结扎冠脉是一种更高效的建模方法。     

心肌再生微环境构建策略

心肌细胞是一种高度分化的终末细胞,自我更新能力差,因而心梗发生后,坏死的心肌细胞不能得到有效的补充,梗死区域很快被纤维组织所取代,严重影响心功能。近年研究发现,利用组织工程手段构建的心肌补片能有效改善心梗区微环境,对心肌的再生能力有着重要的调控作用,能在一定程度上促进心肌再生,缓解心梗状态。该文综述了心肌微环境对心肌再生的调控机制,以及通过心肌补片的手段改善心肌微环境治疗心梗的相关研究,为心肌补片的设计和心梗的治疗提供参考。     

PI3K和Akt蛋白在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表达

目的研究异丙肾上腺素(ISO)致大鼠心肌肥厚中PI3K和Akt在心肌组织中的表达,为探讨心肌肥厚的信号转导机制和逆转心肌肥厚提供形态学资料.方法健康成年SD大鼠20只,随机分为实验组、对照组,每组10只.实验组给予异丙肾上腺素处理.1周后处死大鼠,取心肌组织,常规石蜡切片,HE染色,观察心肌组织的病理变化,测量心肌肥厚指标;免疫组织化学染色和免疫荧光染色,检测p-PI3K和p-Akt的表达及分布.结果实验组大鼠心肌肥厚指标与对照组相比均明显升高;免疫组织化学检测显示,实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达面积和平均光密度较对照组高.免疫荧光检测实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达较对照组高.结论小剂量持续给予 ISO 能建立大鼠心肌肥厚模型;p-PI3K和p-Akt蛋白表达均与心肌肥厚的发生和发展过程相关,PI3K/Akt信号通路激活,可能是导致心肌肥厚的机制之一.     

H9c2心肌细胞多巴胺受体的表达

为明确H9c2心肌细胞是否能够表达多巴胺受体（dopamine receptor,DR）,应用RT-PCR和Westernblot-ting分别检测H9c2心肌细胞和SD成年雌鼠左心室心肌组织中,DR的两种亚型,D1DR和D4DR的表达.结果发现,H9c2心肌细胞可在mRNA和蛋白水平上表达出与SD大鼠心肌组织相同的产物.这说明能以H9c2心肌细胞为研究材料,进一步深入研究心肌D1DR和D4DR基因的表达调控机制以及心肌DR的功能.     

NO和氧自由基在心肌缺血再灌注损伤中的协同作用——心肌缺血再灌注损伤产生的NO自由基的ESR研究

用低温电子自旋共振(ESR)技术检测到了大鼠心肌缺血再灌注过程产生的NO自由基与含铁蛋白结合的ESR信号 并且利用这一技术研究了大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中NO和氧自由基的协同作用.结果发现,在缺血再灌注损伤的心肌中可同时检测到氧自由基和与血红蛋白β-亚基铁结合的NO自由基(β-NO复合物).在正常心肌中检测不到这两个信号,即使在灌注液中加入L-精氨酸也检测不到这两个信号.在缺血再灌注损伤的心肌中就可以检测的这两个信号了,而且随着在灌注液中加入L-精氨酸浓度的增加,这一信号也随之增加.在灌注液中加入NO合成酶抑制剂N~G-硝基精氨酸甲脂(NAME),这两个信号受到抑制.在灌注液中检测标志心肌损伤的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性发现,在灌注液中加入低浓度的L-精氨酸(1mmol/L以下),对缺血再灌注心肌损伤有一定保护作用,但是,若加入高浓度L-精氨酸,则加重缺血再灌注心肌的损伤.加NAME对缺血再灌注心肌有明显保护作用.在灌注液中加入黄嘌吟/黄嘌吟氧化酶(X/XO)或Fe²⁺/H₂O₂,同时增加缺血再灌注心肌中的NO和氧自由基含量,并加重心肌的损伤.在灌注液中加入超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),同时减少缺血再灌注心肌中NO和氧自由基的含量,并减轻心肌的损伤.     

研究报告：MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪来源的心脏干细胞生物学特性的影响

近年来,鉴于心肌组织独有的电生理特性,应用导电纳米材料作为细胞支架开展心肌组织工程研究取得明显进展．碳纳米管材料具有良好的力学性能和导电特性,前期研究表明,其具有促进新生鼠心肌细胞中未成熟心肌细胞增殖与成熟心肌细胞进一步发育的作用,但尚未见碳纳米管材料对棕色脂肪来源的心脏干细胞(CSCs)生物学特性影响的研究报道．为此,本研究首先采用凝胶-溶胶法制备了羧基化多壁碳纳米管和聚甲基丙烯酸甲酯 (MWNTs/PMMA)薄膜,并通过一系列细胞学、免疫细胞化学及电镜检测方法,系统评价了MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪CSCs活力、增殖能力及向心肌分化效率的影响．研究发现,与明胶材料相比,MWNTs/PMMA薄膜对棕色脂肪CSCs活力、增殖能力有明显促进作用,并且明显增强其向心肌细胞分化的能力,分化的心肌细胞具有明显可见的肌管结构,并且表达介导细胞间电化学传导的缝隙连接蛋白connexin43．此外,超微结构观察发现碳纳米管与细胞膜间及细胞与细胞之间可直接形成紧密连接,调控细胞行为．本研究首次探讨了碳纳米管导电材料对棕色脂肪CSCs生物学特性影响的规律,证实碳纳米管导电材料具有良好的促心肌细胞分化作用．作为一种新型导电纳米材料,碳纳米管在心肌组织工程研究中具有良好的应用前景,未来有望在心肌组织体外构建及心肌梗死治疗性应用中发挥潜在的价值．     

核素门控心肌灌注显像对乳腺癌化疗后心肌损害的早期诊断价值分析

摘要 目的：探讨核素门控心肌灌注显像（GMPI）对乳腺癌化疗后并发心肌损害的早期诊断价值。方法：选择2018年8月至2020年4月在徐州市中心医院接受化疗的乳腺癌180例患者,化疗方案均选择蒽环类药物（以注射用盐酸表柔比星为主）,进行6个周期（每周期为21 d）的治疗,在化疗前后对180例患者均行超声心动图及GMPI检测,并按照不同检测方式分为常规组（n=180）与研究组（n=180）,常规组采用超声心动图进行检测,研究组采用GMPI进行检测。于化疗前（A1）、化疗第2周期末（A2）、化疗第4周期末（A3）、化疗第6周期末（A4）分别行超声心动图及GMPI检测,观察两种检查参数在不同时间点的变化情况;对比两种检测方式对心肌损害的检出率差异;绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估两种检测方式对乳腺癌化疗患者发生心肌损害的早期诊断价值;再次绘制ROC曲线评估GMPI中具有显著变化的不同参数对化疗后发生心肌损害的临床诊断价值。结果：超声心动图参数显示随着蒽环类药物剂量的增加,左心室射血分数（LVEF）呈显著下降趋势（P＜0.05）,其他参数变化未见显著统计学差异（均P＞0.05）;GMPI参数显示随着蒽环类药物剂量的累积增加,LVEF呈显著下降趋势,相位标准差（SD）、相位直方图带宽（BW）、熵呈显著上升趋势（均P＜0.05）,其他参数变化未见显著统计学差异（均P＞0.05）;GMPI对乳腺癌化疗后发生心肌损害的检出率显著高于超声心动图（P＜0.05）;ROC曲线显示,GMPI对乳腺癌术后化疗后产生心肌损害的曲线下面积显著高于超声心动图（P＜0.05）;另一ROC曲线结果显示,相比于GMPI单一参数检测,联合参数检测对诊断乳腺癌化疗后出现心肌损害的曲线下面积显著较高（P＜0.05）。结论：相比于超声心动图,GMPI显像能更有效的在早期诊断出患者在化疗后是否发生心肌损害,且运用GMPI中的多参数联合检侧能进一步提高化疗后并发心肌损害的诊断率,可为乳腺癌化疗后心肌损害的早期诊断提供临床参考。     

辛伐他汀通过钙调神经磷酸酶通路抑制压力负荷性心肌肥大

目的:研究在压力负荷下辛伐他汀对钙调神经磷酸酶介导的心肌肥大的影响.方法:选用SD大鼠随机分为3组:假手术组(n=10)、单纯模型组(n=10)和辛伐他汀组(n=10).大鼠通过腹主动脉缩窄建立压力超负荷模型,8周后测定左室重量指数,B超检测左室形态结构,Westernblot检测心肌CaN蛋白表达,RT-PCR法检测心肌CaNmRNA水平.结果:①单纯模型组和辛伐他汀组心肌肥厚指数明显高于假手术组,辛伐他汀组心肌肥厚指数明显低于单纯模型组(P＜0.05).②单纯模型组和辛伐他汀组心肌CaN蛋白及CaNmRNS表达水平高于假手术组(P＜0.05),辛伐他汀组低于单纯模型组(P＜0.05).结论:辛伐他汀可能参与干预钙调神经磷酸酶介导的通路从而抑制心肌肥厚的形成.     

二氮嗪再灌注处理通过抑制细胞内ROS信号保护心肌细胞

恢复心肌血流量是目前针对急性心肌梗塞的有效治疗方式,但是在心肌再灌注过程中会进一步引起心肌细胞的坏死和调亡。二氮嗪是一种线粒体ATP敏感型钾离子通道开放剂,研究证明二氮嗪预处理具有心肌保护功能。本研究主要探讨二氮嗪再灌注处理是否具有心肌细胞保护作用并探讨其分子机制。以体外培养的H9c2心肌细胞为研究对象,通过联合缺氧模拟在体心肌缺血复灌损伤,检测细胞凋亡、线粒体膜电位、细胞内活性氧及钙离子各项指标的变化。结果发现,与正常组(control)相比,缺血再灌损伤组(ischemia-reperfusion injury,IRI)细胞活性显著下降,细胞凋亡率显著升高,线粒体跨膜电位(MMP)下降,同时细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和钙离子大量爆发,二氮嗪在这一过程中通过抑制细胞内ROS的增加、保护线粒体膜电位起到心肌细胞保护作用,并且其保护作用与细胞内另一种重要的第二信使钙离子没有直接关系。     

心肌样微环境诱导脂肪干细胞分化的研究

微环境在促进干细胞分化过程中起着重要的作用,研究心肌样微环境介导脂肪干细胞向心肌细胞分化有重要意义．将脂肪干细胞与心肌细胞直接或通过细胞培养小室间接共培养,检测脂肪干细胞的分化情况．对于直接共培养体系,采用绿色荧光蛋白CFSE对脂肪干细胞进行标记,然后与心肌细胞以1∶5混合后进行直接共培养,2周后,通过流式细胞仪分选分化的脂肪干细胞,并检测其分化情况．检测方法包括：扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构;免疫细胞化学检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白(TnⅠ)和连接蛋白(Cx43);Western blot定量分析;RT-PCR检测心脏特异性转录因子mRNA的表达．结果表明,分化的脂肪干细胞呈现心肌样超微结构,并表达心肌特异性蛋白和转录因子,并且直接共培养体系中分化的脂肪干细胞其表达率明显高于间接共培养体系中的表达率．因此,在心肌样微环境中,除了可溶性细胞因子对分化起作用以外,心肌细胞产生的机械牵拉对脂肪干细胞向心肌细胞分化也起着重要的作用．     

心肌蛋白的错意突变

心肌蛋白（MYOCD）是一种转录辅激活剂．它能同心肌细胞增强因子（MEF2）或血清反应因子（SRF）相结合．激活心肌或平滑肌基因程序。然而，心肌蛋白平滑肌同型异构体却缺乏心肌蛋白氨基端同源结构域（MHD）．因此具有较高的活性。在本研究中．研究者借助他们鉴定出的一稀有的错意突变．对MHD在活性调节中的这一功能进行了探测。这一突变体就是MYOCDK259R，     

miR-22心肌特异转基因斑马鱼的构建及心肌肥厚的评估

目的:构建miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,在体评估miR-22对于心肌肥厚的作用。方法:构建pTol2-CMLC2-miR-22-IRES-EGFP表达载体。通过显微注射的方法将tol2重组质粒于一细胞期注射入斑马鱼受精卵胚胎中,荧光筛选获得心肌特异表达绿色荧光的斑马鱼胚胎,并稳定表达传代。然后对稳定传代的成年斑马鱼心脏进行心肌肥厚及心功能的检测。结果:成功建立了miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,通过定量PCR确定心肌中miR-22表达升高,荧光显微镜观察发现斑马鱼心肌出现绿色荧光。miR-22心脏特异过表达的转基因鱼系的成年鱼与野生对照组相比,出现了心肌肥厚的现象,心肌肥厚分子标志物nppa、myh7明显升高。斑马鱼心脏病理切片结果同样显示出miR-22心肌特异转基因斑马鱼出现了心肌肥厚的现象。结论:成功构建了miR-22心肌特异转基因斑马鱼,为研究心肌中miR-22的生物学功能提供了重要的工具,并证明miR-22心脏特异过表达会引起斑马鱼心肌肥厚。     

穿心莲内酯对大鼠心肌肥厚的影响

研究穿心莲内酯(AP)对由腹主动脉缩窄所致大鼠心肌肥厚的抑制作用。采用腹主动脉缩窄法制备大鼠心肌肥厚模型,10天后开始每天一次的AP0.5,1.0,2.0g/kg给药,共10周。测定心脏质量指数(HMI)、左心室质量指数(LVMI);检测血清及心肌组织的乳酸脱氢酶(LDH)和左心室心肌组织乳酸(LAC)、游离脂肪酸(FFA)含量。同假手术组相比,心肌肥厚模型组大鼠心肌组织LDH明显降低,其他指标明显升高;AP低中高给药组中,中、高剂量组各个指标明显改善。AP对心肌肥厚具有较好抑制作用,其具体原因可能与调节心肌细胞产能机制有关。     

心肌肌红蛋白含量的生化测定方法

本文介绍了两种简便易行、定量测定心肌肌红蛋白含量的方法。利用其中一种方法测定了大鼠心肌肌红蛋白含量,并比较常氧和低氧大鼠心肌肌红蛋白含量的差异     

克山病与心肌线粒体病

克山病是我国一种严重的地方性心肌病. 1984 年政府曾组织对克山病高发地区之一—云南省楚雄地区进行综合性科学考察. 考察队由流行病学、生态环境、临床防治、病理学、生物化学等方面的专家组成, 历时3年(1984~1986年). 通过考察, 病理学、生物化学、生物物理、临床治疗等方面的研究结果均显示克山病患者心肌线粒体的病变是一个重要特征. 该病的具体表现为心肌线粒体代偿增生、数目增多、嵴膜破坏、氧化磷酸化酶系(包括琥珀酸脱氢酶、细胞色素c氧化酶、琥珀酸氧化酶、H^＋-ATP酶等)活性明显下降, Ca²⁺含量增高、心磷脂和辅酶Q含量偏低, 从而提出: “克山病是一种心肌线粒体病”的观点. 在此之前, 对“心肌线粒体病”仅有极少的个例研究报道. 通过楚雄考察, 对众多克山病病例进行大量、多方面的测试与分析, 获得十分珍贵的研究资料. “克山病是一种心肌线粒体病”的提出, 是楚雄考察的重要成果之一, 它不仅是对克山病的发病机理的深入认识, 而且对“心肌线粒体病”的研究都是很有意义的. 与其它“心肌线粒体病”不同, 克山病不属于遗传性疾病, 而与营养不足(特别是缺乏微量元素硒)密切相关. 克山病都发生在缺硒地带, 而补硒对克山病有明显的预防作用. 随着我国人民生活水平的提高, 克山病发病率逐年下降, 目前已降至极低的水平. 近年来国际上对非克山病的心肌线粒体病的研究日益增多. 本文结合这方面的研究进展对“克山病是一种心肌线粒体病”作一简短评述.