人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog 基因 表达的比较

目的:比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞(iPSCs)与人胚胎干细胞(hESCs)分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法:收集分化不同时间点的拟胚体(EBs),检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果:iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论:通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养

摘要: 通过人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。将约5×106个hESCs注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤, 8周后再从畸胎瘤中分离MSCs并鉴定, 将MSCs作为hESCs的滋养层细胞, 并检测和观察hESCs的生长情况、细胞特性和分化能力。从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群, 其形态相似、表面抗原标志相似(CD34和CD45阴性, CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性), 经诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs在MSCs滋养层细胞上传代培养10代以上, hESCs依然具有正常的细胞形态, 反转录PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达, 干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性, SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性, 碱性磷酸酶染色显示为阳性, 并且核型正常。体外EB形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。因此来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。     

Nanog基因的功能与调控

胚胎干细胞的无限增殖能力和亚全能性决定了它在再生医学、新药开发及发育生物学基础研究中具有巨大的应用前景。探索维持胚胎干细胞亚全能性的因子及其网络的调控功能成为胚胎干细胞生物学研究的热点。已研究发现多个与维持胚胎干细胞亚全能性相关的基因如Oct4,Nanog,Sox2等,其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因,它对维持胚胎干细胞亚全能性起关键性作用,能够独立于LIF／Stat3维持ICM和胚胎干细胞的亚全能性。几年来,Nanog的生物学功能及其与Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究,并发现多个调控Nanog表达的转录因子,从而进一步明晰Nanog与已知调控胚胎发育的信号通路之间的关系。在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上、重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系,并对未来的研究趋势予以展望。     

多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞

为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体．使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC．采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定．结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成三胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中．因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础．     

限定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程为多能性细胞

尝试运用限定因子融合蛋白建立猪的诱导多能性干细胞．试验采用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种限定因子经慢病毒表达载体系统介导感染猪胎儿成纤维细胞,对表达外源限定因子的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,细胞集落生长状态稳定、核型正常、碱性磷酸酶检测为阳性,免疫细胞化学检测显示,Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性,体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤．结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导多能性干细胞,为进一步完善诱导方案和深入研究应用猪诱导多能性干细胞奠定了基础．     

Nanog基因的功能与调控研究进展

胚胎干细胞的无限增殖能力和亚全能性决定了它在再生医学、新药开发及发育生物学基础研究中具有巨大的应用前景。探索维持胚胎干细胞亚全能性的因子及其网络的调控功能成为胚胎干细胞生物学研究的热点。已研究发现多个与维持胚胎干细胞亚全能性相关的基因如Oct4, Nanog, Sox2等,其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因,它对维持胚胎干细胞亚全能性起关键性作用,能够独立于L1F/Stat3维持ICM和胚胎干细胞的亚全能性。几年来,Nanog的生物学功能及其与 Oct4, Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究,并发现多个调控Nanog表达的转录因子,从而进一步明晰Nanog与已知调控胚胎发育的信号通路之间的关系。本文在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上、重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4, Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系,并对未来的研究趋势予以展望。     

Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞

目的：Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞的研究。方法：利用小鼠慢病毒载体pWPT-Oct4联合包装质粒包装病毒,含有PEG6000的病毒浓缩液对病毒原液进行浓缩;慢病毒浓缩液感染利用两步胶原酶灌流法分离培养的小鼠肝细胞;RT-PCR检测肝脏、胰腺谱系及多能性转录因子表达。结果：含有Oct4慢病毒感染小鼠原代肝细胞后,Oct4出现表达,肝细胞相关转录因子（Alb、Afp）表达逐渐下降,内胚层早期标志物Foxa2的表达随时间的增加而减弱,Sox17在感染后12d、18d出现表达,并表达胰腺发育过程中的关键性基因-胰十二指肠同源异盒蛋白-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）;不表达Nanog及Sox2等多能性基因。结论：在Oct4介导下成功去分化小鼠原代肝细胞,出现Pdx-1阳性细胞。     

致心律失常性右室心肌病患者的诱导性多能干细胞系的建立

目的：建立致心律失常性右室心肌病（ARVC）患者特异性的诱导性多能干细胞（iPSCs）,为研究ARVC发病机制提供研究模型。方法：培养来源于ARVC患者皮肤成纤维细胞,并进行突变位点测序鉴定。通过仙台病毒转导入外源性多能转录因子,将ARVC患者皮肤细胞诱导为iPSCs,结合免疫荧光法,实时荧光定量PCR,以及体内外三胚层形成实验对iPS细胞全能型进行鉴定。通过调控Wnt信号通路诱导iPS细胞定向分化为心肌细胞。结果：ARVC患者来源的iPSCs显示碱性磷酸酶阳性,多能性相关基因高表达,胚胎干细胞标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-81阳性。体外悬浮培养形成的拟胚体以及体内畸胎瘤形成实验均显示ARVC-iPSCs具有向3个胚层分化能力。经过体外心肌定向,ARVC-iPSC可诱导产生自主节律性搏动细胞团,免疫荧光显示cTnT阳性。结论：本研究使用仙台病毒,建立了无插入型ARVC患者特异的诱导性多能干细胞系,该细胞系具有多能分化特性,并可定向分化为心肌细胞,为研究ARVC的致病因素和药物筛选提供宝贵的实验模型。     

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

两种细胞来源的21-三体综合征诱导多能干细胞系的建立及比较

21-三体综合征是染色体异常导致的疾病,通过重编程21-三体综合征患儿两种组织来源的细胞成为多能干细胞,比较两种组织来源的细胞建立21-三体综合征诱导多能干细胞（T21-iPSCs）系的效率,为进一步研究21-三体综合征发病机制提供细胞模型,并为选择高效制备T21-iPSCs的组织类型提供理论依据。该实验利用慢病毒介导4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分别诱导人21-三体综合征的羊水细胞和胎儿皮肤成纤维细胞,建立诱导多能干细胞系（Trisomy 21 human amniotic fl uid induced pluripotent stem cells,T21 hAF-iPSCs;Trisomy 21 human dermal fi broblast induced pluripotent stem cells,T21 hDF-iPSCs）,T21 hAF-iPSCs及T21 hDF-iPSCs在蛋白和mRNA水平上均表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog等,具有在体外及体内分化三个胚层的能力,其在培养过程中能维持异常核型并能维持自我更新状态。结果发现,利用羊水细胞建立T21-iPSCs效率高于皮肤成纤维细胞,羊水细胞可能是制备T21-iPSCs的理想细胞类型。     

Monoclonal antibody K312-based depletion of pluripotent cells from differentiated stem cell progeny prevents teratoma formation

Human pluripotent stem cells (PSCs) have been utilized as a promising source in regenerative medicine. However, the risk of teratoma formation that comes with residual undifferentiated PSCs in differentiated cell populations is most concerning in the clinical use of PSC derivatives. Here, we report that a monoclonal antibody (mAb) targeting PSCs could distinguish undifferentiated PSCs, with potential teratoma-forming activity, from differentiated PSC progeny. A panel of hybridomas generated from mouse immunization with H9 human embryonic stem cells (hESCs) was screened for ESC-specific binding using flow cytometry. A novel mAb, K312, was selected considering its high stem cell-binding activity, and this mAb could bind to several human induced pluripotent stem cells and PSC lines. Cell-binding activity of K312 was markedly decreased as hESCs were differentiated into embryoid bodies or by retinoic acid treatment. In addition, a cell population negatively isolated from undifferentiated or differentiated H9 hESCs via K312 targeting showed a significantly reduced expression of pluripotency markers, including Oct4 and Nanog. Furthermore, K312-based depletion of pluripotent cells from differentiated PSC progeny completely prevented teratoma formation. Therefore, our findings suggest that K312 is utilizable in improving stem cell transplantation safety by specifically distinguishing residual undifferentiated PSCs.     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定简

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

人类胚胎干细胞系H9培养和分化中细胞异质性的发现

目的:在人类胚胎干细胞系H9培养和分化过程中探讨该细胞系的异质性。方法:对人类胚胎干细胞系H9进行体外未分化培养和诱导分化,鉴定其多潜能性和分化状态;在诱导其向拟胚体细胞的分化过程中,检测多潜能相关基因及分化特异基因的表达情况。结果:发现多潜能相关基因(Oct4、SOX2和Nanog)和种系特异性基因(Cdx2、Bachurary、SOX1、Fgf5和AFP)并不限于分别在未分化细胞和分化细胞中表达。结论:提示H9细胞系在培养过程中的非基因异质性现象,为进一步认识胚胎干细胞的自我更新和多潜能性提供了有意义的参考。     

胎儿肺组织来源间充质干细胞的分离、培养、鉴定及重编程初探

该文主要研究将进行胎儿肺部组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived from fetal lung,FL-MSCs）转变成为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。首先使用酶消化法对胎儿肺部组织进行分离,然后采用常规方法进行培养并成功获得成纤维细胞样细胞。使用共聚焦技术检测获得的细胞,发现角蛋白表达呈阴性;共聚焦技术检测c-Myc、Oct4、Nanog以及Nestin四个干性相关因子,发现它们呈阳性;检测成纤维细胞样细胞的免疫表型,符合间充质干细胞的表型判断标准;然后进行诱导分化实验,发现这些细胞可以向成脂、成骨细胞分化,经过以上实验鉴定获得的成纤维细胞为FL-MSCs。使用Yamanaka四因子体系对FL-MSCs进行诱导,可以形成类似人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hES细胞）的克隆,采用核型分析、STR检测分析以及畸胎瘤形成实验初步验证获得的克隆为iPS。