Snai1 miRNA干扰质粒构建及胃癌细胞系稳定株筛选

目的:设计并构建针对Snai1的微小干扰核糖核酸(miRNA),最终鉴定出有效干扰质粒并筛选稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901。方法:设计并构建4对Snai1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR microRNA及1对无效对照microRNA干扰质粒。将干扰质粒用罗氏BD转染试剂转染胃癌细胞株SGC-7901,通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光确定转染效率。分别用不同浓度l的杀稻瘟菌素作用于SGC-7901细胞,得到杀稻瘟菌素对SGC-7901细胞的筛选浓度。Westernblot检测4对干扰质粒、阴性对照质粒对snai1蛋白水平表达的影响。结果:测序表明,Snai1干扰序列及读码框完全正确,干扰质粒瞬时转染的SGC-7901细胞系在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光达85%以上。杀稻瘟菌素对于SGC-7901细胞的筛选浓度为5μg/ml。Westernblot结果显示,干扰序列Mi-1对Snai1有较强的干扰效果。结论:成功构建了Snai1干扰真核表达载体,同时筛选出有效干扰质粒及稳定转染株,为进一步研究Snai1在胃癌中的作用奠定了基础。     

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。     

人HIF—1α miRNA干扰质粒的构建及其在Lovo细胞中有效性的检测

目的：构建人HIF—1α的miRNA特异性干扰表达载体并转染人结肠癌Lovo细胞检测其有效性。方法：设计合成针对人HIF—1α基因的特异性miRNA前体寡核苷酸,依次通过退火、连接,构建含HIF—1α前体miRNA的重组干扰质粒pcDNA？6．2-GW／EmGFP—HIF—1α—miR,并转染人结肠癌Lovo细胞,经半定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果：经双酶切及测序鉴定,针对人HIF—1α基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制人结肠癌Lovo细胞中HIF-1αmRNA表达。结论：成功构建针对人HIF—1α基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续HIF—1α基因慢病毒miRNA表达载体的构建及其在结肠癌多药耐药中的相关功能研究奠定基础。     

小鼠CYP2E1基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向小鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒,为探索CYP2E1基因功能奠定基础。方法应用invitrogen设计软件设计两条干扰小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA序列,合成相应的回文DNA序列,退火后分别连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体上,构建两套miRNA真核表达载体CYP2E1-miR1和CYP2E1-miR2,并使用该载体特有的串联方法将两载体上的miRNA前体寡核苷酸序列进行串联成为CYP2E1-miR1-miR2;将上述重组载体分别与构建的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1表达质粒共转染入293T细胞,RT-PCR法鉴定其干扰效果。结果经酶切及测序鉴定,针对鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制共转染入293T细胞的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1质粒的表达,且串联质粒CYP2E1-miR1-miR2优于单独的干扰质粒CYP2E1-miR1及CYP2E1-miR2。结论小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA表达载体构建成功。     

幽门螺杆菌相关miRNA与胃癌关系的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种由内源基因编码长度约为22个核苷酸的非编码RNA,其能抑制靶基因蛋白质表达,有多种生物学功能。越来越多的研究表明,miRNA在多种肿瘤中异常表达,参与肿瘤发生、发展过程。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)作为胃癌的主要致病因素,可通过调节miRNA的表达,在胃癌中起促进或抑制作用。现就Hp相关miRNA在胃癌中的作用作一概述。     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

人HIF-1α miRNA干扰质粒的构建及其在Lovo细胞中有效性的检测

目的:构建人HIF-1α的miRNA特异性干扰表达载体并转染人结肠癌Lovo细胞检测其有效性.方法:设计合成针对人HIF-1α基因的特异性miRNA前体寡核苷酸,依次通过退火、连接,构建含HIF-1α前体miRNA的重组干扰质粒pcDNA?6.2-GW/EmGFP-HIF-1α-miR,并转染人结肠癌Lovo细胞,经半定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性.结果:经双酶切及测序鉴定,针对人HIF-1α基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制人结肠癌Lovo细胞中HIF-1α mRNA表达.结论:成功构建针时人HIF-1α基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续HIF-1α基因慢病毒miRNA表达载体的构建及其在结肠癌多药耐药中的相关功能研究奠定基础.     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系。方法:根据人Gnb211 c DNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入p Lentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证。用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率。使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响。结果:酶切和测序证实RACK1sh RNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 sh RNA的慢病毒载体质粒。慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1sh RNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制。结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

维甲酸核受体RARα真核表达载体的构建、突变纠正及表达

目的构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,并检测其在人肺腺癌细胞A549中表达。方法从小鼠巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,以RT-PCR法扩增RARαcDNA,克隆至真核表达载体pDsRed1-C1中,测序结果显示RARα第1040位A→G,导致其编码蛋白的氨基酸发生改变。通过二次PCR将其纠正,重组载体RedC1-RARα转化大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆做酶切及测序鉴定。脂质体瞬时转染A549细胞,在荧光显微镜下观察RARα的表达。RT-PCR法检测RARα的mRNA水平表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到RARαcDNA,构建其真核表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞得到了成功表达,RARα基因产物定位于细胞核内。结论成功构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,且证实RARα编码蛋白定位于细胞核内,本研究结果为进一步探讨结核分枝杆菌固有免疫机制奠定了基础。     

靶向HIV-1pol的高效人工miRNA的构建与体外抗病毒能力评价

RNAi技术在抗HIV-1治疗研究中已显示出巨大潜力,获得可高效特异抑制HIV-1的RNAi元件是进行相关研究的重要基础。miRNA在抑制和表达方式上相比siRNA具有更多的优势。本研究即探讨构建可高效特异靶向HIV-1的人工miRNA元件。选择以保守性较好的HIV-1pol基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,设计了16个可靶向pol区高保守区段的RNAi靶点,构建表达载体与HIV-1感染性克隆进行共转染抑制实验,筛选显示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特点。以天然miR-30a为基础骨架构建了靶向pol1026靶点的人工miRNA元件,通过与HIV-1感染性克隆质粒的共转染抑制实验验证获得了可有效抑制HIV-1表达的人工miRNA元件(miR-1026E)。通过与携带靶序列的报告质粒的共转染实验证明miR-1026E具有良好的靶点特异性。本研究进一步构建了携带miR-1026E表达元件的重组慢病毒,转导MT-4细胞并对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合miR-1026E表达元件的MT-4-miR1026E细胞克隆,该细胞在体外攻毒实验中可高效抑制HIV-1的复制,具有显著的抑制HIV-1的能力。同时应用实时RT-PCR方法检测显示,miR-1026E在细胞中不会影响内源性代表miRNA(miR-181与miR-16)的表达水平和干扰素效应相关基因stat1的表达水平,具有良好的特异性。所获得的可特异高效抑制HIV-1复制的人工miRNA元件可为抗HIV-1研究提供重要参考。     

Inhibition of HBV gene expression and replication by stably expressed interferon-alpha1 via adeno-associated viral vectors

Background

Interferon‐α2 (IFNα2) is routinely used for anti‐hepatitis B virus (HBV) treatment. However, the therapeutic efficiency is unsatisfactory, particularly in East Asia. Such inefficiency might be a result of the short half‐life, relatively low local concentration and strong side‐effects of interferons. Frequent and repeated injection is also a big burden for patients. In the present study, a single dose of vector‐delivered IFNα1 was tested for its anti‐HBV effects.

Methods

Adeno‐associated viral vector (AAV‐IFNα1) was generated to deliver the IFNα1 gene into hepatocytes. IFNα1, hepatitis B surface (HBsAg) and e (HBeAg) antigens were measured by enzyme‐linked immunosorbent assay and/or western blotting. The level of viral DNA was measured by quantitative real‐time polymerase chain reaction.

Results

AAV‐IFNα1 effectively transduced HBV‐producing cells (HepAD38) and mouse hepatocytes, where IFNα1 was expressed in a stable manner. Both intracellular and extracellular HBsAg and HBeAg were significantly reduced in vitro. In the HBV‐producing mice, the concentration of IFNα1 in the liver was eight‐fold higher than that in plasma. Compared with control groups, HBeAg/HBsAg antigen levels were reduced by more than ten‐fold from day 1–5, and dropped to an undetectable level on day 9 in the AAV‐IFNα1 group. Concurrently, the level of viral DNA decreased over 30‐fold for several weeks.

Conclusions

A single dose administration of AAV‐IFNα1 viral vector displayed prolonged transgene expression and superior antiviral effects both in vitro and in vivo. Therefore, the use of AAV‐IFNα1 might be a potential alternative strategy for anti‐HBV therapy. Copyright © 2008 John Wiley & Sons, Ltd.

     

Construction, identification and application of HeLa cells stably transfected with human PEPT1 and PEPT2

The purpose of this study was to construct stably transfected HeLa cells with human peptide transporters (hPEPT1/hPEPT2) and to identify the function of the transfected cells using the substrate JBP485 (a dipeptide) and a typical substrate for PEPTs, glycylsarcosine (Gly-Sar). An efficient and rapid method was established for the preparation and transformation of competent cells of Escherichia coli. After extraction and purification, hPEPT1/hPEPT2-pcDNA3 was transfected into HeLa cells by the liposome transfection method, respectively. HeLa-hPEPT1/hPEPT2 cells were selected by measuring the protein expression and the uptake activities of JBP485 and Gly-Sar. A simple and rapid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of JBP485 and Gly-Sar in biological samples. The Michaelis-Menten constant (K(m)) values of Gly-Sar uptake by the hPEPT1 and hPEPT2-expressing transfectants were 1.03 mM and 0.0965 mM, respectively, and the K(m) values of JBP485 uptake were 1.33 mM for PEPT1 and 0.144 mM for PEPT2. The uptake of Gly-Sar was significantly inhibited by JBP485 with a K(i) value of 8.11 mM (for PEPT1) and 1.05 mM (for PEPT2). Maximal uptake of Gly-Sar were detected at pH 5.8 (for PEPT1) and pH 6.5 (for PEPT2), suggesting that both HeLa-hPEPT1 and HeLa-hPEPT2 were H(+) dependent transporters. Stably transfected HeLa-hPEPT1/HeLa-hPEPT2 cells were constructed successfully, and the functions of hPEPT1/hPEPT2 were identified using their substrates, JBP485 and Gly-Sar. The transfected cells with transporters were used to investigate drug-drug interactions (DDIs) between JBP485 and other substrates (cephalexin or lisinopril) of PEPT1 and PEPT2.     

靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究

RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础。