RNA干扰猪NHEJ通路修复因子对HR效率的影响

非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)是动物基因组DNA双链断裂(double-strand break, DSB)修复的优选途径,通过与同源重组(homologous recombination, HR)竞争DSB靶点,进而抑制HR的效率。为提高HR效率,本研究针对猪NHEJ通路修复关键因子PNKP、LIG4和NHEJ1的编码序列,设计并合成相应的靶向小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),组成若干对RNAi (RNA interference)系统,将RNAi系统与报告质粒SSA-GFP reporter、HDR -GFP system和ssODN-GFP system共转染至猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs),检测敲低上述NHEJ关键修复因子后对HR的影响。RNAi结果显示,针对PNKP、LIG4和NHEJ1设计的siRNA均可显著敲低PNKP、LIG4和NHEJ1基因的表达(P<0.05)。选择干扰效果最好的siRNA与报告载体共转染PFFs,结果表明干扰PNKP基因表达后可显著提高单链退火(single strand annealing, SSA)修复效率、双链或单链DNA介导的同源重组定向修复(homology-directed repair, HDR)效率分别为55.7%、37.4%和73.1% (P<0.05),而干扰LIG4和NHEJ1分别提高双链和单链介导的HDR效率为37.5% 和 76.9% (P<0.05)。     

动物基因组定点整合转基因技术研究进展

传统转基因技术,如显微注射、转座子、慢病毒转染等将目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。目前该技术的定点整合效率非常低,主要取决于两个方面：一是靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB)的效率;二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒发生同源重组的效率,其中同源重组修复(homologous recombination repair, HDR)是基因组定点整合最为依赖的修复机制。靶位点产生DSB后,机体的DNA修复既可能发生HDR,也可能发生非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ),并且两者之间存在竞争关系,因此激活HDR或抑制NEHJ都可提高定点整合转基因的效率。本文结合影响定点整合的因素,对提高定点整合效率最新探索方面进行了综述。     

序列特异性核酸酶及其在植物基因组定向修饰中的应用

通过对基因组特定区域进行精确定向遗传修饰,一方面可以针对目标序列进行精确突变,获得突变材料,对目标基因功能进行明确鉴定;另一方面可以进行目标序列的精确置换或插入,将外源基因随机导入造成的表达及遗传的不确定性降至最低。传统的基因定向修饰技术仅依赖于细胞自身的同源重组,修饰效率低下,而且还存在位置效应和遗传不稳定等诸多问题。通过引入序列特异性核酸酶（sequence—specificnucleases,SSN）,可以在基因组特定位点造成DNA双链断裂（doublestrandbreak,OSB）,促进依赖于细胞内源“同源重组”及“非同源末端连接”的DNA修复事件的定向发生,实现基因组定向遗传修饰效率的大幅提升。迄今为止,在基因组定向遗传修饰研究及应用领域,已经有多种不同类型的序列特异性核酸酶被有效使用,在多种生物中实现了不同类型的基因组定向遗传修饰。该文首先综述了SSN的结构特征及技术原理,然后对SSN技术在植物基因组定向遗传修饰中的研究进展和应用前景进行了重点介绍。     

哺乳动物基因组靶向修饰阳性细胞富集的报告载体系统研究进展

基因组靶向修饰技术对基因功能研究、基因治疗以及转基因育种研究都具有重要的意义和价值。近年来发展起来的人工核酸酶如ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等的应用大大提高了基因组靶向修饰的效率。但是由于核酸酶表达载体转染效率、核酸酶表达效率及活性以及基因组被打靶后的修复效率等因素在一定程度上制约着基因组靶向修饰阳性细胞的获得。因此富集和筛选基因组靶向修饰阳性细胞是一个亟待解决的问题。报告载体系统可以间接地反映核酸酶的工作效率并有效富集核酸酶修饰的阳性细胞,进而提高基因组靶向修饰阳性细胞的富集和筛选效率。本文主要针对由非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和单链退火(Single-strand annealing,SSA)两种修复机制分别介导的报告载体系统的原理和应用进行了详细的介绍,以期为以后的相关研究提供借鉴和参考。     

同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望

CRISPR系统具有精确识别及剪切特异性DNA序列功能而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势,成为新一代最具代表性的基因编辑技术。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HDR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。该文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR/Cas系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组或非同源末端连接修复途径介导的基因定向编辑技术及应用。     

基因组靶向敲入技术在模式动物中的发展与应用:以斑马鱼为例

基因组靶向敲入是指将特定的外源核酸序列转入细胞或个体基因组中的特定位点,以实现条件性基因敲除、单碱基或序列替换、细胞或基因标记等多种精确和(或)复杂的基因组靶向修饰。通过长同源臂介导的同源重组(HR)和微同源序列介导的同源修复两种途径可实现精确的靶向敲入,非同源末端连接(NHEJ)途径则可介导非精确的靶向敲入,或称靶向插入。一般而言,基于同源序列的精确敲入的效率低于NHEJ诱导的靶向插入。受益于以TALEN、CRISPR/Cas系统为代表的人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术的飞速发展,基因组靶向敲入得以在多个物种中越来越广泛地应用,并极大地推动了基因功能与疾病模型研究。不过,在个体水平上,相比于简单的indel突变,基因组靶向敲入仍较难实现,效率仍然偏低。现介绍基因组靶向敲入的基本原理,并以斑马鱼为例,介绍基因组靶向敲入在模式动物中的应用与相关技术的发展历程,并着重强调实验设计与操作的要点,同时对基因组靶向敲入技术的发展进行了展望。     

基因组编辑技术中供体DNA类型及选择北大核心CSCD

基因组编辑技术能够实现基因组的精确修饰和改造,是后基因组时代研究基因功能和遗传信息的主要手段。传统的基因打靶技术通过低效率的细胞自发同源重组实现目的基因的定点修饰。真核细胞中DNA双链断裂介导的同源重组效率远高于自发同源重组,利用人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂,通过提供适当形式的、含有一定长度同源臂的供体DNA,能够实现相对高效的基因组靶向编辑。本文系统总结了环状质粒、线性化质粒、聚合酶链式反应产物及单链寡聚脱氧核苷酸4种类型的供体DNA在基因组精确编辑研究中的应用及候选原则,以期为以后相关研究中供体DNA的选择、设计提供参考和借鉴。     

基因组编辑技术中供体DNA类型及选择

基因组编辑技术能够实现基因组的精确修饰和改造,是后基因组时代研究基因功能和遗传信息的主要手段。传统的基因打靶技术通过低效率的细胞自发同源重组实现目的基因的定点修饰。真核细胞中DNA双链断裂介导的同源重组效率远高于自发同源重组,利用人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂,通过提供适当形式的、含有一定长度同源臂的供体DNA,能够实现相对高效的基因组靶向编辑。本文系统总结了环状质粒、线性化质粒、聚合酶链式反应产物及单链寡聚脱氧核苷酸4种类型的供体DNA在基因组精确编辑研究中的应用及候选原则,以期为以后相关研究中供体DNA的选择、设计提供参考和借鉴。     

依托泊苷影响HEK293细胞同源重组修复体系

抗肿瘤药物疗效的研究多集中在肿瘤细胞,目前针对正常细胞的研究颇少,有必要建立能进行定量分析的同源重组定量修复体系。我们已建立的模型可以探讨肿瘤药物化疗后对HEK293细胞DSBs修复的继发性后果。通过构建含有带I-SceⅠ酶切位点的同源介导的重组修复底物（homologous direct recombination, HDR）,或单链退火修复（single strand annealing, SSA）底物的细胞株,定量检测依托泊苷 (etoposide,VP-l6)对同源性重组修复(homologous recombination, HR)通路的影响。成功构建了可用于定量检测DNA双链断裂(double-strand break, DSBs)诱导的SSA和HDR修复的正常人HEK293细胞应用模型。细胞毒结果证实,与SSA/293对照组对比,VP-16给药组 16 μmol/L（0.475±0.029 vs 1.000±0.000, P<0.001)细胞活力明显降低;与HDR/293对照组相比,VP-16 给药组16 μmol/L（0.458±0.188 vs 1.000±0.000, P<0.05)细胞活力降低。此外,本研究证实,VP-16抑制SSA修复,VP-16给药组 2 μmol/L与SSA/293对照组相比（0.575%±0.177% vs 1.352%±0.195%, P<0.05）,修复效率降低;VP-16抑制HDR修复,VP-16给药组1 μmol/L与HDR/293对照组修复效率相比（0.305%±0.078% vs. 0.635%± 0.049%,P<0.05),修复效率降低。VP-16诱导DNA损伤的同时,抑制HDR修复和SSA修复,修复效率呈现剂量依赖性。本研究结果可为抗肿瘤药物的临床应用提供某些指导。     

基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景

外源DNA导入细胞并与基因组靶基因发生同源重组可以精确修饰或替换靶基因,但在植物中产生自发同源重组的概率很低.近几年出现的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重组的效率,实现基因组的精确、定向改造.其中,归巢核酸酶、锌指核酸酶和TALE核酸酶已在植物基因工程中得到成功应用,最近开发出来的基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术则更具有高效方便等特点.这些人工核酸酶的应用为植物基因工程的发展呈现了更加美好的前景.首先介绍了基因组编辑技术及其发展历程,随后详细阐述了提高植物基因组定点编辑效率的策略,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望.     

主编导读

<正>本期主编导读主题:碱基编辑、脑细胞芯片、超高通量筛选、微量磷酸化蛋白质富集等技术方法,以及疫苗抗体、多肽药物、治疗用酶、生物材料、生物合成等领域的新进展。1技术方法以CRISPR/Cas9基因编辑系统为代表的基因组编辑技术可以显著提高基因敲除及定点修饰的效率。传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂,诱发细胞内的同源重组和非同源末端连接修复途径,进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。     

不同打靶位点影响人诱导多能干细胞MYO7A杂合突变位点的基因校正中CRISPR/Cas9介导的同源重组效率

应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变（c.4118C>T）的人iPSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链（single-stranded DNA oligonucleotides, ssODN）与打靶质粒共同电转入人iPSCs后48 h,经流式分选出(5.8±2.2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ssODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ssODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9（或其它核酸酶）介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断（double-stranded break, DSB）位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。     

通过同源重组改变基因组

染色体DNA与新导入的克隆DNA序列之间的同源重组(基因的定向导入)可以将经过任何修饰的克隆基因转移到活细胞的基因组中。本文讨论基因定向导入的现状,着重在通过生殖系修饰小鼠的基因组,并介绍几种用来鉴测极少数已有定向导入出现的胚胎干细胞的方法。     

CRISPR/Cas9系统诱导DNA断裂的修复机制研究进展

近年来,聚类规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein 9,Cas9)介导的基因编辑技术已广泛应用在生物学、基础医学等研究领域中,通过该技术构建的动物疾病模型推动了对发病机制的探索和基因治疗等方面的研究进展。Cas9核酸酶切割与随后的同源重组(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)共同完成基因编辑工作,但是HDR发生的效率较低限制了其应用。因此对NHEJ和HDR修复方式的机制研究对于提高基因编辑的精准性及高效性十分重要。该文主要对CRISPR/Cas9系统应用过程中NHEJ和HDR修复系统的发生机制进行总结并结合相关研究进展进行了展望,为高效利用CRISPR/Cas9技术的研究提供了思路。     

利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F₀小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

PBK/TOPK在乳腺癌细胞中介导MEK非依赖性ERK激活中作用机制分析

该文探讨了乳腺癌细胞中表皮生长因子(EGF)介导的MEK非依赖性ERK激活通路。Western blot检测EGF刺激下,siRNA抑制MEK1/2后的T47D细胞的p-ERK水平,以验证T47D细胞中存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活的通路。接着使用可能参与MEK非依赖性ERK激活的激酶的小分子抑制剂抑制相关激酶(AC、PKC、Src、PI3K、PDK1和Akt)活性后,检测T47D细胞EGF介导ERK的磷酸化水平。siRNA抑制MEK1/2表达后,T47D细胞在EGF刺激后的仍保留部分p-ERK,即在T47D细胞中,存在EGF介导的MEK非依赖性的ERK磷酸化通路。小分子抑制剂抑制AC、PKC、Src对MEK非依赖性ERK激活途径影响不大。而使用小分子抑制剂抑制PI3K、PDK1和Akt后,ERK的磷酸化水平显著降低,提示PI3K/Akt通路下游的激酶参与T47D中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。siRNA干扰PI3K/Akt通路下游PBK/TOPK后并使用U0126抑制MEK功能后,几乎检测不到p-ERK,提示PBK/TOPK参与T47D细胞中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。乳腺癌抗雌激素药物耐药株T47D细胞存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径,且该途径受PI3K/Akt下游的PBK/TOPK调控。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DNA双链断裂修复路径的作用

DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)对细胞生存是致命的.细胞内非同源末端连接(NHEJ)、重组修复(HDR)、单链退火修复(SSA)和微同源序列末端连接(MMEJ)等通路可竞争性修复DNA双链断裂损伤.在肿瘤细胞DNA中制造难以修复的基因损伤,诱导肿瘤细胞周期中止、坏死和凋亡是临床放、化疗的主要策略.组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）作为抗肿瘤治疗的新靶标,其抑制剂(histonedeacetylase inhibitors, HDACi)可显著降低肿瘤细胞DSBs修复能力,增强肿瘤细胞的放、化疗敏感性.研究显示,HDACi抑制了肿瘤细胞中具有正确修复倾向的HDR和经典NHEJ通路,具有错误修复倾向的SSA和MMEJ路径也可能牵涉其中.目前,HDACi作用于DSBs修复通路的分子机制已取得较大进展,但仍有许多问题有待阐明.