果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究

[目的]实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。     

新型猪胃蛋白酶原突变体真核表达体系构建

[目的]构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体真核表达体系。[方法]以含有猪胃蛋白酶原基因的环状质粒pPICZαA-PGA为模板,对猪胃蛋白酶活性关键氨基酸Asp32和Asp215相关的S35、G76、T216和T218 4个位点定点突变;突变质粒鉴定后电转化至毕赤酵母X-33;qPCR鉴定高mRNA表达转化子;以甲醇诱导表达4 d后SDS-PAGE及酶活测定检测目的蛋白。[结果]成功构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体mPG-S35A、mPG-G76A、mPG-T216A和mPG-T 218A;阳性克隆率超过90%;SDS-PAGE检测到清晰的目的蛋白条带,分子量约为48 k Da,4种突变体的酶活分别是11.3 U/mL、22.6 U/mL、16.9 U/mL、13.7 U/mL。[结论]SDS-PAGE检测到4种分子量48 k Da的突变猪胃蛋白酶原清晰条带,四者酶活在11.3~22.6 U/mL之间,成功构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体在毕赤酵母以外分泌表达的体系。     

碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。     

真菌果胶酶的分子生物学研究进展

近10年来国外在果胶酶分子生物学研究上取得了重大进展,从11个属的真菌克隆了50个以上的基因并测序。对果胶酶基因的结构、功能、调控、录译后加工等方面进行了深入探讨。已克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因和果胶裂解酶(PL)基因为主,也有果胶酯酶(PE)基因和鼠李半乳糖醛酸酶(RHG)基因,大多有内含子。前体蛋白一般有N信号肽和糖基化位点。果胶酶一般受果胶、低浓度的(01%)D半乳糖醛酸等诱导,而受较高浓度(1%)的半乳糖醛酸、抗体、某些抗菌素抑制。     

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株（BTC105）中克隆果胶裂解酶基因（PelC）完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希茵BL21（DE3）进行融合表达,在LB（Luria—Bertani）中进行摇瓶发酵,1mmol／LIPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导。结果表明,拘建了表达载俸pET28a－felC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5．4,最适温度为50℃,Ca^2＋对酶活促进作用最为明显,Cu^2＋完全抑制了酶的活性。     

地衣芽孢杆菌碱性果胶酶基因PelA的克隆与原核表达

通过PCR扩增的方法,从本实验室筛选保存的Bacillus licheniformis DG-3 菌株中扩增出碱性果胶酶的结构基因pelA , 序列分析表明,所获PelA 基因与已报道的B.licheniformis 14A菌株的pelA基因的同源性为100%. 将pelA 基因在大肠杆菌中表达,发酵液菌体的碱性果胶酶酶活为12U/mL. 4～8 mmol/L的Ca2 对碱性果胶酶具有显著的激活作用.     

大曲中产果胶酶微生物的分离鉴定及其产酶活力评价

为深入研究大曲中微生物的组成及其产果胶酶特性,本研究对泸州老窖酿酒大曲中微生物进行分离鉴定,得到细菌15株(其中包括6株高温菌株),真菌5株(其中包括3株高温菌株)。以桔皮粉为唯一碳源发酵诱导菌株产果胶酶并采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定酶活,筛选出了两株酶活力最高的菌株,分别为细菌Q-B2和真菌Q-F5。利用16S r DNA以及ITS鉴定高产果胶酶菌株种属,证明与Q-B2及Q-F5最相近种属分别为鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)和嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)。本研究为加深对大曲中微生物的组成认识提供理论依据。进一步探索本实验中分离所得微生物产果胶酶的性质,对P-Q-B2 (Q-B2所产果胶酶)的酶学性质进行测定,结果显示,P-Q-B2的最适pH为3,最适温度为50℃,在pH为3以及5～11的区间内,剩余酶活力都在40%以上;该酶在30～50℃具有良好的热稳定性,证明其在实际生产中具有良好的应用潜力。     

麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达

【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01的果胶裂解酶基因并进行原核表达,对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物,PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1和pACYCDuet-1载体上,导入E.coli BL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后,采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶,研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel(GenBank登录号:JX964997),其序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸。pACYCDuet-1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高,发酵液粗酶活达298.8 IU/mL。其最适反应温度为50°C,最适pH为9.0;保温1 h,酶活稳定温度≤45°C,稳定pH为9.0?10.0。酶催化作用依赖于Ca2+,其最适作用浓度为2 mmol/L;Zn2+、Ca2+和NH4+促进酶活力,Fe3+和Pb2+严重抑制酶活力;聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因,其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。     

果胶酶基因片段的克隆及其序列分析

根据Genbank上登录的果胶酶基因序列设计三对不同果胶酶片段的引物,从本实验室已筛选的一株具有降解果胶质功能的细菌(暂编号为:C105)中克隆到了果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PE)基因片段。通过分析,PL基因片段与PE基因片段均与来源Erwiniachrysanthemi的果胶裂解酶和果胶甲酯酶基因的同源性很高,达到90%以上。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的:利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(APOBEC)3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果:PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论:实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒(PERV)的抑制作用奠定了基础。     

体外模拟猪胃条件下木聚糖酶活力稳定性研究

木聚糖酶是饲用复合酶制剂的主要酶系之一,本实验对某木聚糖酶在体外模拟猪胃条件下酶活力的稳定性进行了研究.结果表明:实验所用酶最适温度为50℃左右,最适pH为5.5左右;酶的耐热性能比较好,pH稳定性范围为5～8,体外模拟猪胃条件下木聚糖酶稳定性实验表明,酶活损失较大,经不同方法处理木聚糖酶,酶活损失百分率大小顺序为:胃蛋白酶<新鲜猪胃液<胃蛋白酶+金属离子.     

黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA在PK15细胞中的分泌表达

通过RT-PCR方法,从黑曲霉总RNA中克隆出β-甘露聚糖酶基因manA的成熟肤编码序列.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肤序列通过重叠延伸PCR方法得到拼接片段,并插入到真核表达载体pcDNA6.0/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSmanA.重组质粒经过PCR、酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且读码框完全正确.在脂质体介导下将pcDNA-PSmanA转染猪肾(PK15)细胞进行分泌表达,通过RT-PCR方法证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测酶活性得到β-甘露聚糖酶基因酶活性为14.5 IU/mL.     

PGI、PGⅡ在胃癌组织中的表达及意义

目的：研究胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)在胃癌组织中的表达及意义。方法：将我院2011 年5 月至2013年10月 收治的上消化道疾病患者243 例纳入研究,根据胃镜及病理组织学结果,按照胃癌、慢性萎缩性胃炎、慢性非萎缩性胃炎、不典型 增生以及胃溃疡分为5 组,对照组为57 名来我院检查的健康的人群。应用酶联免疫法测定各组血清PGI、PGⅡ的含量并计算胃 蛋白酶原比值(PGR),比较胃癌患者手术前后血清PGI、PGⅡ的含量以及PGR,并通过ROC曲线下面积评价血清PGI、PGⅡ以及 PGR 诊断胃癌的效能。结果：与对照组比较,胃溃疡组PG I、PG II均明显升高,PGR 降低(P<0.05),慢性萎缩性胃炎组、不典型增生 组及胃癌组PGI、PGR均明显降低(P<0.05);与慢性萎缩性胃炎组比较,不典型增生组和胃癌组PGR 显著降低(P<0.05)。手术治疗 后,胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ含量较手术前明显下降(P＜0.05)。血清PGⅠ、PGⅡ以及PGR含量诊断胃癌的ROC 曲线下面积依 次为0.779、0.920 以及0.991。结论：胃癌患者血清PGI、PGR均明显降低,二者可用于初步筛查胃癌。     

禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析

果胶裂解酶是果胶酶的重要成员之一,能够通过B-消除作用,催化降解（1—4）-α-D-聚半乳糖醛酸。本研究首次鉴定出禾谷镰孢茵中的一个果胶裂解酶PelA,并在体外检测了其生化特性。PelA基因（FGSG_02386）的cDNA被克隆并进行了原核表达,同时构建了单基因敲除突变体。将重组质粒pET-28a（＋）-PelA转化蛋白表达菌株大肠杆菌BL21表达目的蛋白,纯化后的蛋白具有果胶裂解酶活性。酶活性测定结果显示,该酶的活性受到外界环境因素如温度、钙离子浓度和pH条件的影响,其最适反应条件为50℃,CaCl：浓度0-5mmol·L^-1,pH8-5。在侵染小麦胚芽鞘时PelA单基因突变体的毒力较野生型菌株并没有出现明显变化。     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表达

本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因,并将其克隆到表达载体pINA1297中,得到表达载体pINA1297-phyA,利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中,通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株,阳性菌株在YM培养基中28℃培养6d后酶活达到最大为636.23U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130kDa,但通过去糖基化处理后其分子量变为51kDa,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶在pH2.0~8.0处理1h后仍有较高酶活,并且90℃处理10min后还有86.08%的残留酶活,其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。     

片烟产果胶酶细菌的鉴定及酶活测定

以果胶为碳源, 对津巴布韦片烟烟叶表面产果胶酶细菌进行分离, 采用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性分析(ARDRA)和测序方法, 结合形态学、生理生化实验, 对所分离产果胶酶菌株进行鉴定, 同时研究培养时间、温度、起始pH、接种量对菌株产酶的影响。结果表明, 从津巴布韦片烟烟叶表面分离得到的产果胶酶菌株主要为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和产碱菌属的粪产碱菌Alcaligenes faecalis。在所分离的菌株中, 枯草芽孢杆菌T10酶活力最高, 以6%的接种量, 在温度为35 °C、起始pH为7.5条件下培养48?56 h, 其果胶酶酶活为571 U/mg, 聚半乳糖醛酸裂解酶酶活为297 U/mg。     

根际微生物产生的植物激素对小麦生长的作用（简报）

根际微生物PGI和PG6培养液中含有生长素、赤霉素和细胞分裂素。用PGI和PC6接种小麦能显著促进幼苗的生长发育,它们对幼苗根形态的影响与植物激素处理的效果相似。施加生长素和细胞分裂素的生理前体色氨酸及腺嘌呤和异戊醇更加促进PG1和PG6对小麦幼苗根茎的生长。关键词##4根际微生物;;植物激素;;小麦     

米曲霉(Aspergillus oryzae)果胶酸内切水解酶(PGA)在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉(Aspergillusoryzae)一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonaseA,PGA)的cDNA,PGAcDNA连入pET-28a( )载体,构建pET-28a( )-pga质粒。pET-28a( )-pga转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a( )-pga-Turner(DE3)placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220r/min条件培养pET-28a( )-pga-Turner(DE3)placⅠ细胞,OD600至0·8左右时,用500μmol/Lisopropylβ-D-thiogalactogalactopyranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87·5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活。