用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

大鼠胎脑神经干细胞HPRT基因的敲除

根据已知大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HypoxanthineGuaninePhosphoribosylTransferase ,HPRT)基因的外显子序列 ,从大鼠HPRT基因组DNA序列的细菌人工染色体 (BacterialArtificialChromosome ,BAC)中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的 3 0kb的 5′长臂 (LongArm ,LA)和 1 7kb的 3′短臂 (ShortArm ,SA) ,并分别克隆到pSL1180和pCR2 1中。进一步构建大鼠HPRT基因打靶载体———pKO HPRT ,经酶切鉴定后的大鼠HPRT基因敲除载体用NotⅠ酶切使其线性化 ,经溴乙锭、正丁醇、酚、酚 /氯仿提纯后 ,将终浓度调至 1μg μl。在FuGene 6转染试剂的作用下转染培养 2 4h的第二代大鼠胎脑神经干细胞 (RatFetalNeuralStemCells,rFNSCs)。转染后的细胞用 80 μg mlG4 18和 0 2 μmol L的Ganc全培养液筛选 ,2w后将存活细胞进行悬浮培养 ,使细胞形成球形物 ,挑选单个的球形物进行单克隆增殖 ,其中一部分细胞 (约 2～ 3× 10 3)用裂解液处理 ,取上清用于PCR检测 ,大部分细胞 (5× 10 7)用于DNA和RNA的提取 ,进行Southernbolt和RT PCR检测 ,剩余细胞冷冻保存。最后 1次实验共分离培养了 32个rFNSCs单克隆 ,其中 3个单克隆 (9 3% )经PCR、Southernbolt和RT PCR证实HPRT基因已被敲除     

利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。本实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47Kb无启动子的HPRT基因组片段（不含有第1个外显子）克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于本实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。     

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶研究进展

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT)是一种细胞质酶, 在体内广泛存在, 它不仅参与嘌呤碱基的补救合成途径, 而且关系到嘌呤类药物的代谢, 是调控该类药物药理效应和毒性反应的关键酶。其基因突变可影响酶的活性, 不仅可能导致不同临床表现的代谢疾病的发生, 而且影响体内嘌呤类药物的代谢。同时, HPRT作为管家基因, 是诊断许多疾病的靶点基因。文章概括了HPRT研究的新进展, 通过总结国内外研究现状, 发现HPRT的研究既推动了嘌呤类药物个体化用药的发展及新药物的研发, 又促进了HPRT突变相关遗传代谢疾病的诊断和治疗。     

黄鳝Hprt基因的克隆及表达分析

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)参与嘌呤核苷酸的补救合成。采用RACE技术克隆了黄鳝的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因,它的全长cDNA 为1 452 bp,预测编码218个氨基酸,与人类、小鼠、鸡和斑马鱼等脊椎动物Hprt氨基酸序列之间的同源性超过76.7％。基于该基因氨基酸序列构建了进化树,显示与斑马鱼Hprt基因更同源。RT-PCR表明黄鳝Hprt基因在多种组织中广谱表达,表明黄鳝该基因在功能和进化上的保守性。      

Lesch-Nyhan综合征家兔模型的建立及其表型分析

Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome,LNS)是一种先天性的嘌呤代谢缺陷病,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase,HPRT)是其主要致病基因,临床特征表现为尿酸分泌过多、痛风、肾结石及肾脏损伤等,目前致病机制尚未被完全阐明且无有效治愈手段。动物模型在疾病致病机理研究和治疗方式探索中发挥着重要功能。本研究采用高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术和显微注射的方式敲除家兔(Oryctolagus cuniculus)HPRT基因建立了LNS家兔模型,以期能更好的模拟该疾病的表型。首先针对兔HPRT基因第3外显子设计一条sgRNA,将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA共注射到兔受精卵中,注射后的胚胎移植到代孕母兔子宫中,待仔兔出生后对其基因型及表型进行鉴定与分析。共出生4只仔兔(分别编号为R1、R2、R3和R4),测序结果显示4只仔兔都产生了不同程度的基因修饰,基因编辑效率达100%,其中R4仔兔T载体测序结果在基因编辑靶点未检测到野生型序列。通过6-硫代鸟嘌呤(6-Thiogua...     

医学分子遗传学第十讲基因治疗

基因治疗是人类征服遗传性疾病最有希望的手段。基因治疗是指通过遗传操作直接在基因水平上治疗由基因突变所引起的遗传性疾病。进行基因治疗有两个基本策略:(1)原位修复有缺陷的基因;(2)将有功能的正常基因转移到疾病细胞或个体基因组的某一部位上以替代缺陷基因发挥作用。目前条件下,后者是比较容易着手的一种基因治疗策略,也称为基因替代疗法。在早期进行基因治疗尝试时,最适合的对象应当是一些产物量无需精确调节,同时又经常开放的基因。首选对象有(1)次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT),由于这种酶的缺乏,在人类中可引起自毁容     

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶突变体的基因构建、表达和性质

通过对我国嗜热菌Thermoanaerobactertengcongensis中次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)三维结构进行同源模建 ,设计出HGPRT的突变体K1 33A、K1 33S和K1 33T。用抗性筛选法 ,对HGPRT的基因进行了定点突变 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。野生型HGPRT及其突变体K1 33A、K1 33S和K1 33T的催化动力学研究表明 ,HG PRT突变体改变并扩大了底物专一性 ,具有催化嘌呤类似物的活性。     

日本血吸虫中国株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的克隆、表达及其免疫保护性研究

根据基因库中日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) EST (BU803192) 以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjHGPRT基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接,获得SjHGPRT全长cDNA (1 270 bp),经序列分析,推断该片段含有编码SjHGPRT基因的完整阅读框,其编码基因与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (SmHGPRT) 全长编码基因碱基一致性为82%,其理论推导的氨基酸组成与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的一致性约为83%. 将其编码基因克隆到表达载体pQE30上,在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达,表达产物分子质量约为28 ku. 用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行蛋白质印迹检测,在预测位置上出现明显的识别条带. 重组蛋白动物免疫保护性结果显示：在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和雌子宫内卵数方面,疫苗组与对照组比较差异均具有显著性 (P < 0.05,P < 0.01). 结果表明,日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (SjHGPRT) 全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达,表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果,是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗血吸虫病疫苗候选分子.     

人源Cdc25C蛋白的融合表达及纯化

目的:表达并纯化有活性的GST-Cdc25C融合蛋白,以用于Cdc25C功能研究。方法:利用RT-PCR克隆MCF-7细胞的cdc25c全长基因;在大肠杆菌中表达GST-Cdc25C融合蛋白;利用GSH交联的琼脂糖珠纯化GST-Cdc25C融合蛋白;通过体外磷酸酶活性分析检测GST-Cdc25C融合蛋白的磷酸酶活性。结果:克隆获得1465 bp的人源cdc25c全长基因,并克隆至pGEX-4T-1原核表达载体;在原核系统中可溶性表达了相对分子质量约87×103的GST-Cdc25C融合蛋白;通过亲和纯化获得的GST-Cdc25C融合蛋白具有较好的磷酸酶活性。结论:得到了有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白,可用于后续的Cdc25C功能研究。     

麻疹疫苗诱发中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K_1)染色体畸变和基因突变的研究

实验证明,麻疹病毒及其疫苗可诱发染色体畸变。近年来,病毒活疫苗诱变性的研究由细胞水平深入到基因水平,已经发现脊髓灰质炎疫苗和流感疫苗可诱发中国仓鼠细胞(V79)HGPRT位点突变,但有关麻疹疫苗的研究,还未见报道。本实验以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核糖转移酶位点突变检测系统(CHO/HGPRT)检测国产麻疹疫苗的诱变性,为麻疹疫苗遗传安全性的认识提供依据。     

抗8氮鸟嘌呤的F9胚胎癌细胞突变株的建株

近年来,小鼠胚胎癌细胞(EC 细胞)已成为研究胚胎分化、肿瘤发生的一个很好的实验模型。利用体外培养的 EC 细胞,通过诱变剂处理和筛选,可以获得具有特定基因突变标记的 EC 细胞株。例如利用碱基类似物8氮鸟嘌呤(8AG)或5-溴脱氧尿嘧啶核苷可以分别筛选到次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)缺陷的突变株。前者同时又是人类列许尼汉(Lesch-nyhan)综合症的病因。因此建立这种类型的突变株,不仪可以利用酶的缺陷突变作为细胞融合的选择     

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。     

KEAP1基因及其突变位点对非小细胞肺癌细胞株作用的实验初步研究

摘要 目的：研究KEAP1基因及KEAP1基因突变位点对肺癌细胞株的作用。方法：通过Western blot 方法,比较携带KEAP1 基因突变的肺癌细胞株（A549,NCI-H460,NCI-H838）与KEAP1 基因野生型的肺癌细胞株（NCI-H292, NCI-H1299, 95D, SPC-A1）之间,NRF2基因与NRF2下游基因HO-1的蛋白表达水平,检测并比较两组细胞的活性氧（ROS）含量;以新发现的非小细胞肺癌（NSCLC）病人的 KEAP1 体细胞突变作为模板构建 KEAP1 突变质粒,对自身存在 KEAP1 突变的肺癌细胞株A549,通过改造的 pMSCV 逆病毒转染体系,分别构建过表达空载,野生型及突变型 KEAP1 的 A549 稳定细胞株,比较过表达不同质粒的细胞间丙二醛（MDA）含量及 NRF2 下游抗氧化等相关基因的表达水平;通过克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果：KEAP1基因突变组肺癌细胞株与KEAP1基因无突变的对照组细胞株相比,NRF2和HO-1蛋白表达显著增高,活性氧水平显著降低（P<0.01）;过表达野生型KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因转录水平表达显著下降（P<0.01）,蛋白水平表达下降,细胞内丙二醛水平显著增高（P<0.01）,克隆形成率显著降低（P<0.01）,而过表达突变型 KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因表达、细胞内丙二醛水平、克隆形成率均无显著差异（P>0.05）。结论：KEAP1基因具有抑癌作用,其突变为失活型突变,突变后KEAP1/NRF2通路激活,KEAP1基因突变可能通过改变细胞的氧化应激水平,促进肺癌的发生发展。     

禽流感病毒血凝素基因突变体的构建及其在293T细胞中的表达

采用PCR定点突变技术,通过重叠延伸法3次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pcDNA3载体中,DNA测序表明在预期位点已经发生突变,HA基因裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF,通过磷酸钙共沉淀方法将HA基因突变体的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用间接免疫荧光鉴定其表达情况。IFA证实突变后的HA在细胞膜上获得了有效表达。HA基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点导致AIV进入细胞的发病机制和HA蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293/K562细胞株

该文旨在利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293/K562细胞株,为G6PD缺陷症及其修复研究提供细胞模型。针对G6PD基因c.1388GA位点设计单链向导RNA(sg RNA)与突变同源臂,利用CRISPR/Cas9联合同源重组修复(HDR)构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293细胞株与红白血病K562细胞株; qRT-PCR、Western blot检测G6PD基因表达; CCK8检测细胞增殖;G6PD/6PGD比值法检测G6PD酶活性;结晶紫染色与Annexin V-APC/7-AAD验证突变细胞株对氧化活性药物维生素K3与伯安喹的耐受情况。结果显示,成功构建CRISPR/Cas9双质粒载体系统;筛选单克隆细胞经测序鉴定显示,成功构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293与K562细胞株,且无脱靶;进一步发现, c.1388GA突变不影响HEK293与K562细胞G6PD基因mRNA转录与蛋白翻译,但细胞增殖减慢, G6PD酶活性下降;突变HEK293细胞对维生素K3与伯安喹的耐受力减弱,突变K562细胞对伯安喹耐受能力减弱。该研究成功构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293与K562细胞株,为G6PD缺陷症及后期基因修复研究提供细胞模型。     

昆明山海棠诱导人白血病细胞HPRT基因突变的研究

为研究昆明山海棠(THH)的遗传毒性和药理作用,采用单细胞克隆培养,双向筛选计数,多重PCR扩增与电泳分析,研究了THH诱导HL－60细胞HPRT基因突变率及分子突变谱。发现随着染毒剂量的增加,细胞接种存活率逐渐下降,突变频率明显升高;THH诱发突变主要由缺失和点突变两部分组成(46.6％和53.4％),而自发突变几乎全是点突变(92.3％);HPRT基因突变位点在各个外显子的分布较集中于基因的3′末端,且外显子1缺失只出现于全基因缺失中,外显子7/8与9多表现为连锁缺失(71.4％)。结果提示,THH具有明确的诱导HPRT基因突变的作用,且诱发突变与自发突变的分子图谱不一样,这可能与其作用机制有关。上述发现有助于阐明THH遗传毒性作用机理。 Abstract:The genotoxicity and pharmacologic activity of a Chinese medicinal herb,Tripterygium hypoglaucum(Lévl) Hutch (THH),was investigated by methods of single cell clone culture,two-way screening count,multiplex PCR amplification and electrophoresis technique.THH showed clear cytotoxicity and mutagenesis in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells.When doses were increased,cell plating efficiency reduced and mutation frequency increased.The analysis showed that the spectra of spontaneous and THH?induced mutants were different.46.6％ of THH?induced genetic changes were deletions,whereas the majority of spontaneous mutants(92.3％)exhibited point mutations.Mapping of all intragenic deletion breakpoints showed a random distribution of breakpoints in 9 exons,but toward the 3′ end of the HPRT gene.Exon 1 deletion only appeared in total gene deletion,and exon 7/8 and 9 deletion often showed chain deletion(71.4％).     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。