小麦Beclin1类似基因的分子克隆与鉴定

以小麦 簇毛麦 (Triticumaestivum Haynal diavillosa) 6VS/6AL易位系 92R1 3 7为材料 ,应用mRNA差异显示和快速扩增cDNA末端 (rapidam plificationofcDNAends,RACE)技术对在白粉菌(Blumeriagraminis)诱导后表达增强的基因进行了克隆。分离到一个与拟南芥Beclin1类似基因同源的全长cDNA克隆 ,暂定名为小麦Beclin1类似基因。它编码 441个氨基酸组成的多肽。二级结构推导显示与人类Beclin相似 ,具有螺旋结构。Northern杂交分析表明 ,小麦Beclin1类似基因在白粉菌诱导后表达增强。Southern分析证明 ,小麦Beclin1类似基因为单拷贝基因     

IBV广东分离株GD05 S1基因的克隆、鉴定及其表达

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Brochitis virus,IBV)属于冠状病毒科冠状 病毒属,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.近年来,由于新的I BV变异毒株不断出现,从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发,造成严重的经济损失 [1, 2]}.IBV的基因组为单股RNA,主要编码3种主要结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M) 和 核衣壳蛋白(N),其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基.S1蛋白是IBV的主要免疫原 基因,可刺激机体产生中和抗体,决定病毒的组织亲嗜性,在病毒血清学分类中起主要作用 [1,3].     

小麦分蘖角度TaTAC1基因同源克隆及表达分析

分蘖角度影响植物群体结构、光合效率以及植株的形态建成,最终影响其产量及品质。小麦中关于分蘖角度的研究鲜有报道。前人研究显示,水稻OsTAC1正向调控分蘖角度的大小,玉米Zm TAC1与叶片角度呈正相关。本研究的目的是解析Ta TAC1的表达模式并初步了解该基因的分子遗传机制及其与分蘖角度的遗传关系。本研究以CN16、SM969、Lan2399、SHW-1为材料,利用同源克隆分离获得Ta TAC1,利用生物信息学软件对Ta TAC1进行序列特征分析,应用实时荧光定量PCR对其表达模式进行分析,并进行Ta TAC1蛋白的亚细胞定位分析。结果显示,Ta TAC1长度约1.1~1.2 kb,包括780 bp的完整开放阅读框和320~370 bp的3'-UTR。Ta TAC1的c DNA序列分为2类,其中CN16-2、SM969-2的第10号碱基发生突变,引起终止子提前,导致Ta TAC1表达受阻;Lan2399-2和SHW-1-2在109~115碱基位置有"CGCGCG"片段插入,导致蛋白质β-折叠片减少。表达分析表明,Ta TAC1在分蘖期的叶鞘、茎高效表达,分蘖节其次,叶与根表达量最低。相关分析表明该基因在分蘖节各时期表达量与分蘖角度呈显著正相关,Pearson相关系数为0.677,其他组织表达量与分蘖角度无显著相关性。亚细胞定位分析显示Ta TAC1定位于细胞膜。从上述结果可以推测Ta TAC1在mRNA水平上正向调控分蘖角度,且可能参与生长素极性运输过程从而改变分蘖角度大小。     

松材线虫galectin-1基因的克隆、原核表达和表达模式分析

【目的】galectin-1是凝集素的一种,广泛存在于各种生物体内,在生长发育、免疫调节方面起重要作用。本研究克隆和表达了松材线虫的galectin-1蛋白,并分析了各个龄期的表达量。【方法】设计引物,扩增松材线虫的galectin-1基因,使用双酶切的方法连接p ET-28a载体和目的基因,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆;在不同温度下,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检验蛋白表达情况;采用RT-PCR技术检验松材线虫各个龄期galectin-1基因的表达情况。【结果】由SMART和Predict Protein软件分析可知,该蛋白有2个结构域,并且主要由无规卷曲和β折叠构成;生物学信息分析显示,松材线虫的galectin-1与小卷蛾斯氏线虫的相似性更高;与日本血吸虫相比,线虫能很好地聚集在一个分支上。Western blot检测纯化蛋白大小与查询所得蛋白分子质量一致。RT-q PCR结果显示,以繁殖型2龄松材线虫(L_2)为对照,galectin-1基因在繁殖型3龄(L_3)、繁殖型4龄(L_4)、扩散型3龄(L_(Ⅲ))和扩散型4龄(L_(Ⅳ))松材线虫中的表达量高,尤其是在LⅢ中的表达量最高;雌雄成虫没有显著性差异。【结论】松材线虫的galectin-1基因在p ET-28a原核表达系统中呈可溶性表达,在不同龄期的表达量有差异。本研究为进一步研究松材线虫的galectin-1基因奠定了基础,为松材线虫的防治提供了新的方向。     

小麦BBC1基因cDNA的克隆与分析

从小麦(Triticum aestivum L．)中克隆了一个BBC1基因的cDNA。分析结果表明,该基因编码一亲水多肽,富含丙氨酸、赖氨酸、精氮酸和谷氦酸。该基因的转录受低温调控。在小麦基因组中,BBC1基因以一个小家族的形式存在。     

普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析

为研究抗白粉病小麦（Triticum aestivum L．）品系在小麦白粉病菌（Blumeria graminis f. sp．tritici）侵染后有无LRK10同源基因表达,依据小麦蛋白激酶LRK10和其它植物蛋白激酶第6亚结构域设计了一个5’-RACE兼并性引物。以接种小麦白粉病菌后的小麦抗白粉病品系“99—2439”幼苗叶片cDNA为模板进行5’-RACE扩增,获得了一个1551bp长的蛋白激酶基因cDNA片段（S1125,GenBank登录号：AY584533）。此后,通过RACE技术成功地获得了该基因的全长cDNA克隆。该克隆编码637个氨基酸组成的多肽。同源性查寻表明,该基因属于先前命名为wfrk（wheat leaf rust kinase）的小麦类受体蛋白激酶基因家族。与LRK10相似,这个新的小麦类受体蛋白激酶有5个明显的功能域：位于氨基端的疏水信号序列、推测的胞外结构域、跨膜域、高荷电序列和位于羧基端的丝氨酸／苏氨酸激酶域,因此被命名为TaLRK（Triticum aestivum LRK）。以小麦肌动蛋白基因为对照,通过半定量反转录PCR（semi—QRT—PCR）技术对叶片中TaLRK基因在小麦白粉病菌接种后的转录水平表达谱进行了研究。结果表明,小麦白粉病菌的侵染使TaLRK基因的转录显著增强。组织特异性表达分析证明,这一基因仅在小麦的绿色部分表达。研究结果提示TaLRK可能参与了小麦的抗白粉病反应。     

小麦TaEDR1基因dsRNAi表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(TriticumaestivumL.)品系99/2439中分离到一个编码促分裂原蛋白激酶激酶激酶的新基因TaEDR1。为了研究TaEDR1基因在小麦抗白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal)反应中的作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,选择TaEDR1基因编码胞外结构域的、保守性低的cDNA区域作为RNA干扰的目标区段,将这个区段连接成一个反向重复序列(3′→5′//5′←3′),插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成双链RNA干扰表达载体pAH-R-TER。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种“周麦18”为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了7个转基因植株,为研究小麦TaEDR1基因的功能奠定了基础。     

小麦几丁质酶基因Wch2的克隆与表达分析

利用小麦几丁质酶基因PCR特异片段为探针,分离克隆了一个小麦Chidl几丁质酶基因Wch2。该基因编码311个氨基酸,不含内含子,具有一个信号肽、一个富含半胱氨酸的几丁质结合区域、两个变异区、两个酶活性区域。Southern分析表明,在小麦基因组中Wch2有多个拷贝。秆锈菌接种诱导Wch2在一对小麦近等基因系中差异表达;在抗病系中国春Srll中,接种3d后Wch2开始表达,6d后表达量更高;而在感病等基因系中国春srll中,在所有取样分析的时间内均未检测到Wch2表达。将Wch2克隆到细菌表达载体pET22b,在细菌中表达的重组Wch2具有几丁质酶活性。这些结果说明,分离的Wch2基因在小麦秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

小麦TaCRC基因的克隆及表达分析

以小麦心皮为材料,利用RT-PCR方法分离出一个新的YABBY基因TaCRC,并利用Northern杂交对TaCRC在不同组织中的表达模式进行分析.结果显示:该基因全长1 105 bp,编码199个氨基酸.TaCRC具有YABBY家族典型的结构域,即N端含有C2C2锌指结构域,C端含有YABBY结构域.其氨基酸序列与水稻的 DROOPING LEAF(DL)、拟南芥的CRABS CLAW(CRC)和金鱼草的AmCRC的氨基酸具有较高的一致性.TaCRC在心皮中特异表达,类似于拟南芥的CRC的表达模式.研究表明,TaCRC是小麦中的CRC同源基因.     

核桃JrNPR1基因的克隆与抗病响应潜力

病程相关基因非表达子NPR1（Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1）基因,在植物抗病过程中起核心调控作用。核桃（Juglans regia）是我国乡村振兴的重要经济油料树种,其生长和产量严重受病虫害制约。为探索核桃抗病生理机制,筛选抗病基因,以‘香玲’核桃为试材,克隆获得JrNPR1基因,对其基本生物信息和病害响应进行分析,预测JrNPR1响应病害的功能。结果显示：JrNPR1基因开放读码框（ORF）长1 782 bp,包含593个氨基酸,理论等电点为6.40;与杨梅（Morella rubra）、蓖麻（Ricinus communis）等同源蛋白进行多序列比对,发现均有NPR1-like-C保守结构域,且JrNPR1与杨梅和欧洲栓皮栎（Quercus suber）等的同源蛋白具有较近的进化关系。其上游1 233 bp启动子中含有多种与植物抗病相关的顺式作用元件,如,WRKY71OS。在胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、矩圆黑盘孢菌（Melanconium oblongum）、黄单胞菌（Xanthomonas campestris）等病原处理下,JrNPR1被显著诱导,且其表达在水杨酸（Salicylic acid,SA）存在下高出单一病原处理的1.31~178.89倍。表明JrNPR1基因可能是抵抗核桃炭疽病、枝枯病、细菌性黑斑病的重要基因,且涉及SA信号通路。     

小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFD1基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子。利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L.)中分离到一个UFD1类似基因。该基因的编码区长948 bp,编码长315个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74％的同源性。在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域。我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为了UFD1。Southern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的。无论是在单子叶中还是在双子叶植物中,UFD1蛋白都高度同源。除了N端UFD1结构域外,该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域。TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达。     

用半定量RT-PCR方法分析小麦TaMlo-A1c基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(TriticumaestivumL.)TaMlo-A1c基因的表达进行了研究。结果发现:TaMlo-A1c基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。     

小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFD1基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子.利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L.)中分离到一个UFD1类似基因.该基因的编码区长948 bp,编码长315个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74%的同源性.在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域.我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为TUFD1.South-ern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的.无论是在单子叶中还是在双子叶植物中,UFD1蛋白都高度同源.除了N端UFD1结构域外,该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域.TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达.     

小麦抗病基因表达谱中的文库构建与筛选方法研究

以抗白粉病品系“百农 32 17×Mardler”BC5F4为材料 ,构建了白粉病菌诱导的普通cDNA文库和抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。分别对两文库进行了一定规模的测序 ,获得普通cDNA文库不重复ESTs 387条和SSHcDNA文库ESTs 76 0条。将获得的ESTs与GenBank序列进行了BLASTn、BLASTx同源性分析。结果表明 :在普通文库中 ,一些参与光合作用与核糖体构成等的基因出现频率较高 ,而获得的抗病相关基因则较少。消减文库在构建方法、抗病相关基因的富集等方面具有明显的优越性 ,是目前抗病基因表达谱研究中的较好方法。利用高密度点阵膜杂交技术对两文库的筛选结果表明 ,该方法具有相对简便易操作、杂交膜可反复使用等优点 ;但也存在mRNA及同位素用量大等问题。经筛选 ,消减文库中有 5 4 1%的功能已知ESTs为抗病相关基因 ,被证明参与了小麦抗白粉病反应     

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

 胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析

根据R基因及其调控基因保守序列设计简并性引物,对白粉菌接种和未接种处理的一对抗病和感病的小麦—黑麦等位突变易位系TAM104R和TAM104S总RNA进行RT-PCR扩增,得到一个诱导表达的cDNA片段。序列分析表明,该片段全长2474bp,其中含有一个822bp的完整开放阅读框,推测其编码一个有273个氨基酸残基、分子量约31kD的蛋白质分子。蛋白质的氨基酸序列比对显示,该蛋白质分子具有C2HC锌结合motif CX2CX4HX4C结构和锌指domain,可见克隆的cDNA是一个锌指蛋白基因,命名为TaZF。Southern杂交表明,TaZF在抗病易位系TAM104R的基因组中是多拷贝的。半定量RT-PCR分析显示,TaZF基因属组成型表达、但受白粉菌诱导表达上调的基因,推测其与白粉病菌的侵染过程相关。基因组DNA专化扩增、克隆和测序揭示TaZF基因无内含子。