猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间的抗原性关系

我们应用中和试验在不同细胞上对干扰素血清与猪脾细胞干扰素(PSIFN)及人干扰素(HuIFN-α)的中和能力进行了试验,结果证明HuIFN-α多克隆抗体具有明显的中和PSIFN的能力。而人免疫干扰素(Hu IFN-γ)抗体具有微弱的中和猪脾细胞干扰素能力。猪脾细胞干扰素不仅可在同源细胞表现出抗病毒活性,而且可在异源细胞表现出较高的抗病毒活性。应用人白细胞干扰素多克隆抗体亲和层析可有效地分离猪脾细胞干扰素,证实猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间具有高度的同源性关系。     

美洲商陆及中国商陆皂苷对正常人外伤脾及病人脾细胞体外诱生免疫干扰素的效用

10例正常人外伤脾及8例各种疾病切除的脾,取其全脾细胞,在体外分别用美洲商陆(PWM)及中国商陆皂甙诱生出的干扰素,证明是免疫干扰素(IFN—r);10例外伤人脾以PWM诱生IFN—r平均效阶为3.40±0.59Log CPI50u/ ml,以中国商陆皂甙诱生效价为2.92±0.42Log CPI50u/ml两者效阶有显著差异(P<0.05或0.01)。8例各种病人脾细胞以美洲商陆诱生出IFN—r效价平均达3.69±0.35Log CPI50u/ml;以中国商陆皂甙诱生者,平均效价为3.01±0.35Log CPI50u/ml两者差别有极显著意义(P<0.01)。讨论中关于美洲商陆对人外伤脾及病人脾细胞诱生的IFN—γ效价皆较高于病人脾的原因,认为除两种商陆的物理化学性质不同外,又可能与两者能否同时激活T及B细胞有关。文中强调不应使用癌症转移的脾细胞诱生IFN—r,因为产量不高,对人使用不安全。     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。     

不同型别的基因工程干扰素抗病毒活性的比较

对大肠杆菌生产的不同型别的基因工程干扰素rIFN-α1(α1)、rIFN-αA(αA)、rIFN-β17ser(β17ser)和rIFN-γ(γ),以及自然人白细胞干扰素nIFN-αco,在不同细胞上对不同病毒的抗病毒活性做了比较研究。证明:①α1抗病毒作用的细胞谱较广,尤其在牛肾MDBK细胞和猪肾PK细胞上有很高的活性,分别为在人细胞上的29倍和7倍。β17ser和γ在异种细胞上活性极低,在鼠、猪和牛肾细胞上的活性为人细胞上的1～2％以下。②5种干扰素对麻疹、CoxB1、Sindbis、腺病毒7型和Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的抗病毒活性无明显差异。但不同病毒对干扰素的敏感性有明显差别,以Sindbis病毒为最敏感,7型腺病毒最不敏感。③5种干扰素对流行性出血热病毒均有明显的抗病毒作用,尤以人α1型和β干扰素作用最强,α1对出血热病毒的抗病毒活性是对滤泡性口膜炎病毒(VSV)的1/2.85,人β干扰素是对VSV的1/4.1。上述结果为人基因工程干扰素的临床应用提供了实验依据。     

猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较

干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质,主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)α、γ、αγ及ω基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-α、pET-His/PoIFN-γ、pET-His/PoIFN-αγ和pET-His/PoIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明猪α和αγ融合干扰素有较为显著的抗病毒活性,抗PRRSV活性高达108U/mg;猪γ干扰素活性效价约为α干扰素的1/2到1/3;猪ω干扰素几乎未检测到抗病毒活性,需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。     

重组马g-干扰素抗病毒活性测定及单克隆抗体抑制活性鉴定

为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马g-干扰素是否具有抗病毒活性, 利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78), 然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP), 观察干扰素对病毒表达GFP的抑制, 测出其抗病毒活性单位分别为1×103 AU/mL、1×105 AU/mL。评价了制备的九株抗重组马g-干扰素单克隆抗体是否可抑制重组马g-干扰素抗病毒活性, 证实其中一株可中和重组马g-干扰素的抗病毒活性。结果表明: 杆状病毒表达的马g-干扰素具有较高的抗病毒活性, 其活性可被一株制备的抗重组马g-干扰素单克隆抗体抑制; 首次获得原核表达的具有抗病毒活性的马g-干扰素。     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

志贺氏菌属弗氏2a染色体基因文库的构建

以λ噬菌体EMBL3作载体,用体外包装技术构建了志贺氏菌属弗氏2a染色体基因文库。该体外包装系统的包装效率达1.6×10~2pfu/μg DNA,重组噬菌体的产量达2×10~6pfu/μg DNA。对重组噬菌体进行了遗传分析,即分别对7个标记(leu,pro,his,arg,thr,purIaroA)作了测定。测得当噬菌体母液的效价为8.7×10~8pfu/ml时,带有以上标记的重组噬菌体的效价为5×10~4-8.2×10~5pfu/ml。这个令人满意的结果为尔后克隆志贺氏菌属弗氏2a染色体上的与群抗原3,4和型抗原Ⅱ有关的基因打下了基础。     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

幽门螺旋菌在双相培养基中生长特性的研究

本文观察了幽门螺旋菌在固体及液体—固体双相培养基上生长的特性,37℃72小时培养后,定量实验表明,固体培养基上菌数为1.02×10~2cfu/ml,而双相培养基上则为1.14×10~4cfu/ml;用血液双相培养基,对CP进行了生长曲线的测定,从0小时加入1.02×10~2cfu/ml开始,按每天平皿活菌计数,共5天(24、48、72、96、120、144h)分别为2.5×10~2cfu/ml,4.97×10~2cfu/ml,1.14×10~4cfu/ml,1.24×10~5cfu/ml,2.87×10~5cfu/ml,9.75×10~4cfu/ml以后逐日下降;液相培养液24—144小时pH测定,pH由7.2下降至6.4—6.9。     

酿酒酵母原生质体融合及其融合子的鉴定

应用原生质体融合技术,得到乙醇产量较高的两株多倍体酵母菌融合子F_(28)和F_(38),融合频率为2×10~(-5)。测定融合子F_(28)、F_(38)每个细胞内DNA含量分别为2.14×10~(-8)、2.34×10~(-8)μg,而亲株DNA含量分别为0.78×10~(-8)和1.24×10~(-8)μg。并进行了融合子细胞增殖率、乙醇发酵能力及同功酶分析等试验。用固定化细胞发酵乙醇试验结果表明,在pH4.0,17％糖蜜为基质情况下,发酵3小时,融合子F_(28)、F_(38)的乙醇产量分别为77.21和77.09mg/ml;亲株乙醇产量仅为65.00mg/ml和68.40mg/ml。为固定化细胞发酵乙醇提供优良菌株。     

部分酶解酵母高效电击转化研究

以酵母质粒YCp50为外源DNA,电击转化部分酶解酵母宿主菌AB1380,转化效率稳定在10~6转化子/μg质粒DNA左右,比不酶解酵母或酵母原生质球作受体的电击转化效率高一个数量级以上,也比PEG介导的酵母原生质球转化高3～5倍,而且适合于大片段DNA如水稻YAC分子的转化。达最佳转化时的有关技术参数为:新接菌种通气培养至细胞密度1×10~8～1.5×10~8个/ml;转化时细胞密度控制在1×10~9～1.5×10~9个/ml;每毫升酶解缓冲液加15u溶菌酶(lyticase),30℃下处理酵母5min进行部分酶解;电击时,电场设置在6.25kV/cm、电容25μF,电击后直接铺板。     

α干扰素和利巴韦林抗丙型肝炎病毒作用的比较研究

α干扰素(IFN-α)联合利巴韦林是目前临床治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的标准方案.本研究以体外培养的感染性病毒HCVcc为研究对象,比较IFN-α和利巴韦林对HCV复制的影响,以及对干扰素调节因子9(IRF9)和干扰素刺激基因15(ISG15)等抗病毒基因的调节能力.结果显示,100 u/ml IFN-α显著降低HCV RNA水平,利巴韦林剂量依赖性抑制HCV复制,且IFN-α联合利巴韦林对HCV复制及HCV NS3和E2蛋白表达具有协同抑制作用.5～80 u/ml IFN-α剂量依赖性诱生IRF9和ISG15;1和5μg/ml利巴韦林不促进IRF9和ISG15水平升高;而利巴韦林联合IFN-α对两者亦无促进作用.     

鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性

用紫外线灭活的草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导鲫鱼囊胚细胞(CAB)能产生一种高滴度的抗病毒物质.这种物质在56℃及pH 2～11稳定;对胰蛋白酶敏感;抗病毒活性受被保护细胞的密度、培养温度及保护时间的影响;不能被GCRV的特异性抗体中和;无直接杀病毒作用;抗病毒机制依赖于细胞内RNA和蛋白质的合成;在多种鱼类培养细胞中具有抑制病毒作用.这些特性与哺乳类α/β干扰素一致,是一种鲫鱼干扰素.     

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

人体细胞漫谈

人体细胞的数目人和所有行有性生殖的生物一样,都是由一个细胞——受精卵发育而来的.据推算,刚出生的婴儿全身约有二十万亿(2×10~(18))个细胞.经过二十多年的分裂生长,成人体内细胞约为三百万亿(3×10~(14))个. 据估算,人体神经系统内含有10~(11)个神经细胞(又叫神经元),仅大脑皮层就约含140亿个神经细胞.如果以成人体内血量平均为4.5升计算,成年男性体内红细胞约为2.25×10~(10)个(500万个/mm~3×4.5×10~3);女性体内红细胞约1.89×10~(10)个(420万个/mm~3×4.5×10~3;白细胞2.25×10~7～4.5×10~7个;血小板约为4.5×10~8～1.35×10~9个.     

CHO细胞表达重组猪干扰素-γ及其抗病毒活性

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,r Po IFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建r Po IFN-γ真核表达质粒pc DNA3.1-Po IFN-γ,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8实验分析r Po IFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15系统检测其抗病毒活性效价;最后分析r Po IFN-γ对塞内卡病毒A (Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用。结果显示,本研究利用CHO悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的r Po IFN-γ,该r Po IFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15系统检测其活性效价为5.59×107 U/mg;此外,r Po IFN-γ可诱导细胞内多种ISGs和细胞...     

用微载体悬浮培养系统增殖细胞和病毒

我们用我院制备的MC-1型微载体成功地培养了BHK-13,BHK-21,和CHO-KI三株细胞。当微载体浓度为5mg/ml,细胞接种量为30×10~4细胞/ml左右时,一般在三天都可达到1×10~6细胞/ml。此时接种10~(-1)或10~(-2)的VSV,在37℃培养20-24小时,病毒产量可达到6LogTCTD_(50)/ml以上,其中以CHO-KI细胞的产量最高,它们与静止培养的细胞产量基本一致,也不亚于鸡胚细胞增殖的产量。目前用该系统增殖的VSV已用于IFN的研究工作中。实验的结果也表明,用该系统增殖其它病毒和制备疫苗,以及大量培养已引入重组IFN基因的CHO工程细胞也将是可行的。     

北极狐g-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐g-干扰素的生物学活性, 应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出g-干扰素(VuIFN-g)cDNA。序列分析表明VuIFN-g cDNA全长501 bp, 编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白, 与已发表的银黑狐和犬IFN-g 核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%; 氨基酸同源性均为100%。应用原核表达系统高效表达北极狐g-干扰素成熟肽蛋白, SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD, 以不溶性的包涵体形式存在。重组蛋白经纯化和复性, 在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制, 并测出北极狐重组g-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg, 为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础。     

用扁桃体淋巴细胞生产白细胞干扰素的研究

本文报告了用手术切除的正常人新鲜扁挑体细胞制各白细胞干扰素,较适宜的条件是扁桃体在离体后8小时内应用,以1640作为培养液,按每毫升含10个活细胞、200IC粗干扰素起动、128HA的NDV诱导培养18—24小时,pH不低于7.0,能较稳定地获得效价平均>40,000IU／ml 的粗干扰素。因粗干扰素效价较高,用KcNs一乙醇法进行一次纯化,部分纯品的比活性即可>10。IU／mg蛋白,回收率50—60％,产品的各项生物制品指标均符合美国NIH标准。一颗新鲜扁挑体一般可得到200—500×107个活淋巴细胞,约相当于400—1,000ml血所分离得到的白细胞量,这在一定程度上解决了血源困难和价格昂贲的问题,扩大了生产白细胞干扰素的细胞来源。