α1,3—岩藻糖基转移酶及其相关产物

α１,３┐岩藻糖基转移酶及其相关产物陈继华陈惠黎（上海医科大学卫生部糖复合物重点实验室,上海２０００３２）关键词α１,３－岩藻糖基转移酶Ｌｅｗｉｓ（Ｌｅ）系抗原细胞表面的糖蛋白或糖脂的一部分含有外链岩藻糖（Ｆｕｃｏｓｅ,Ｆｕｃ）化的乙酰乳糖胺糖链,常...     

α-1,6岩藻糖基转移酶的研究进展

当细胞糖蛋白的糖链发生α-1,6岩藻糖基化时,这种改变直接关系到细胞一系列的生物学特性。本就α-1,6岩藻糖基转移酶编码基因及其蛋白质的结构与表达特征,其底物蛋白的糖链结构,与肿瘤及白细胞黏附缺陷症等疾病的关系诸方面予以综述。     

nm23-H1对全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡及其相关信号转导通路的影响

为了解nm23-H1转染对全反式维甲酸诱导的人肝癌H7721细胞凋亡的影响,本研究通过质粒转染把nm23-H1导入人肝癌7721细胞,建立了nm23-H1过表达稳转细胞株。首先采用MTT法测定细胞生长曲线,再通过流式细胞术和丫啶橙染色法观察细胞凋亡,最后采用Western blot检测凋亡相关的信号通路分子bcl-2、PKB、PKB-Ser473、PKB-Thr308和p53的表达情况。研究发现,nm23-H1转染对人肝癌7721细胞的生长没有影响;但nm23-H1转染能明显促进全反式维甲酸诱导的细胞凋亡,nm23-H1转染细胞凋亡率为18.2%,而对照细胞凋亡率仅为1.0%;nm23-H1和对照细胞的过量表达对bcl-2的表达没有明显影响,但PKB的Ser473和Thr308位的磷酸化显著下调,抑癌基因p53的表达量上调。研究结果表明,nm23-H1的过量表达增加了人肝癌细胞对全反式维甲酸诱导的凋亡的敏感性,因此推测nm23-H1可作为肝癌治疗的有效靶点。     

小鼠α1，2岩藻糖基转移酶基因的克隆及表达

本文报告小鼠GDP岩藻糖：β半乳糖苷α1,2-岩藻糖基转移酶（α1,2-fucosyltansferase,α1,2-FT）基因的克隆,并进行功能鉴定。利用RT—PCR方法克隆小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因编码区MFUT-II,测序后将其插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3．1-MFUT-II;采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过对底物特异性比较研究酶的性质;应用Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况;应用Southern印迹杂交法分析基因存在状态。结果证实MFUT-II为小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因家族的新成员。含有一个完整的开放读码框。可编码347个氨基酸。其估计分子质量为39kDa,和小鼠日及Sec1基因具有序列同源性。分别与人类Se基因（79．O％）、大鼠Ratrrs（89％）基因、兔Rabbit FT-III基因（77％）具有较高的序列同源性。用MFUT-II基因转染的COS-7细胞具有α1,2-FT活性。MFUT-II可在多种组织中产生3．5kb大小的mRNA转录产物。基因Southern印迹杂交分析结果显示：基因MFUT-II仅为一个拷贝。这些结果证明MFUT-II为小鼠的Se基因。     

小鼠α1,2岩藻糖基转移酶基因的克隆及表达

本文报告小鼠GDP岩藻糖:β半乳糖苷α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltansferase,α1,2- FT)基因的克隆,并进行功能鉴定。利用RT-PCR方法克隆小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因编码区 MFUT-Ⅱ,测序后将其插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3．1-MFUT-Ⅱ; 采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过对底物特异性比较研究酶的性质;应用 Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况;应用southern印迹杂交法分析基因存在状态。结果证实MFUT-Ⅱ为小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因家族的新成员,含有一个完整的开放读码框,可编码347个氨基酸．其估计分子质量为39 kDa,和小鼠H及Secl基因具有序列同源性,分别与人类Se基因(79．0％)、大鼠Rat FTB(89％)基因、兔Rabbit FT-Ⅲ基因(77％)具有较高的序列同源性。用MFUT-Ⅱ基因转染的COS-7细胞具有α1,2-FT活性,MFUT-Ⅱ可在多种组织中产生 3．5kb大小的mRNA转录产物。基因Southern印迹杂交分析结果显示:基因MFUT-Ⅱ仅为一个拷贝。这些结果证明MFUT-Ⅱ为小鼠的Se基因。     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

全反式维甲酸联合辛二酰苯胺异羟肟酸诱导MCF-7 细胞凋亡

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)单独及联合应用对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法:培养人乳腺癌MCF-7细胞,待细胞进入对数生长期,加入一定浓度的ATRA和(或)SAHA,采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果:ATRA和SAHA单药及联合应用早期凋亡率均高于对照组,但24 h时测得联合组早期凋亡率低于单药组,48 h、72 h联合组早期凋亡率高于SAHA组却低于ATRA组,差异均有统计学意义(P0.05);联合组死亡细胞和晚期凋亡细胞率之和高于单药组及对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ATRA和SAHA单独或联合作用于乳腺癌MCF-7细胞均可促进细胞凋亡,两药联合应用时诱导细胞凋亡作用更强。     

全反式维甲酸诱导胃腺癌细胞周期阻滞的作用机制

目的:研究全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)对人胃腺癌细胞(SGC-7901)细胞周期阻滞的诱导作用并探讨其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测ATRA对SGC-7901增殖的抑制;流式细胞术检测细胞周期,Western blot方法检测不同浓度ATRA处理后的SGC-7901细胞中Akt、P-Akt(Ser473)、P-Akt(Thr308)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1的表达情况.结果:10.9～10.5mol/L的ATRA作用SGC-7901细胞48 h,能显著抑制细胞增殖,其抑制率分别为10.2%±0.5%、15.3%±0.5%、17.0%±0.7%、28.4%±1.0%和36.9%±0.7%;G1期细胞比率随着ATRA浓度的增加而增加,呈明显的G1期阻滞;Western blot检测显示ATRA对细胞中Akt蛋白的表达没有明显影响,两种p-Akt蛋白的表达显著下调,ATRA显著降低细胞中cyclin D1和p-GSK-3β的表达.结论:ATRA可能通过抑制磷酸化Akt蛋白表达而减少p-GSK-3β的表达,从而减少cyclin D1的表达量,进而诱导SGC-7901细胞发生G1期阻滞.     

全反式维甲酸联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究全反式维甲酸（ATRA）联合替莫唑胺（TMZ）对胶质瘤细胞株U251增殖及凋亡的影响。方法：体外培养胶质瘤细胞株U251,分为ATRA组、TMZ组、ATRA＋TMZ组和空白对照4组,应用MTT法测定U251细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,westernblot法检测细胞维甲酸受体β（RARβ）蛋白和凋亡相关蛋白Caspase．3蛋白的表达情况。结果：对照组、ATRA组、TMZ组及ATRA＋TMZ组的细胞生长抑制率分别为（1．72±0．12）％、（9．87±0．87）％、（23．87＋1．32）％及（35．74±1．44）％,ATRA＋TMZ组的细胞生长抑制率显著高于单独应用TMZ（P〈0．01）。对照组、ATRA组、TMZ组及ATRA＋TMZ组的细胞凋亡率分别为（1．32±0．11）％、（4．16±0．35）％、（8．44±0149）％、（15．27±1．03）％,ATRA＋TMZ组的凋亡率显著高于单独应用TMZ有更高的凋亡率（P〈0．01）。对照组、ATRA组、TMZ组及ATRA＋TMZ组RARp蛋白相对表达量分别0．452±0．054、0．837±0．068、0．195±0．021、0．376±0．039,ATRA＋TMZ组RARβ蛋白相对表达量显著高于TMZ组（P〈0．01）。ATRA＋TMZ组Caspase．的3蛋白表达相对水平为（0．832±0．059）,明显高于ATRA组（0．334±0．041）及TMZ组（0．521＋0．032）,差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论：全反式维甲酸联合替莫唑胺能更有效抑制U251细胞的增殖,增加其凋亡率,这可能与其增加RARβ和Caspase-3蛋白的表达抑制U251细胞增殖、诱导细胞凋亡有关。     

RNA干扰敲减FucT VII表达抑制人结肠癌细胞HT-29和HUVECs的粘附能力

 探讨利用RNA干扰（RNAi）技术抑制岩藻糖基转移酶Ⅶ（FucT Ⅶ）表达对人结肠癌细胞HT-29与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）粘附能力的影响及其机制.本课题构建3对针对FucT Ⅶ基因的RNAi表达载体,并将其转染入人结肠癌细胞HT-29,Western 印迹检测FucT Ⅶ及其下游产物sLeX蛋白的变化;实时PCR 检测FucT Ⅶ mRNA表达的变化;玫瑰红染色法检测RNAi 对HT-29与HUVECs细胞粘附能力的影响.结果显示,3对FucT Ⅶ siRNA表达载体均可有效抑制HT-29细胞FucT Ⅶ mRNA和蛋白表达,以pSilencer 2.0 FucT Ⅶ 2最为有效;与空白细胞组比较,转染pSilencer 2.0-FucT Ⅶ的HT-29细胞表面sLeX表达水平明显下降,以pSilencer 2.0-FucT Ⅶ 2最为显著;RNA干扰FucT Ⅶ表达后HT 29细胞和HUVEC之间的粘附能力明显受到抑制.研究表明,RNAi靶向沉默HT-29细胞中FucT Ⅶ基因表达可显著降低其下游产物sLeX的合成,进而抑制HT-29细胞与HUVECs的粘附能力.     

藻蓝蛋白联合全反式维甲酸对HeLa细胞生长抑制作用的研究(英文)

目的:探讨全反式维甲酸和藻蓝蛋白单独及联合用药对HeLa细胞生长的影响,并揭示两者联合用药对细胞周期和细胞凋亡影响的分子机制。方法:MTT法检测全反式维甲酸和藻蓝蛋白单独及联合用药对HeLa细胞生长的影响,原位杂交法检测用药前后细胞内CDK-4基因mRNA的表达情况,免疫组化法检测用药前后bcl-2基因的表达情况,TUNEL法检测用药前后细胞凋亡情况。结果:全反式维甲酸和藻蓝蛋白均具有抑制HeLa细胞生长的作用,当达到相同的抑制率时,联合藻蓝蛋白使用可以显著降低全反式维甲酸的使用剂量从而达到降低毒副作用的目的。两者联合用药可以显著降低CDK-4的表达量从而对HeLa细胞的细胞周期产生影响。两者联合用药可以显著下调bcl-2的表达水平从而引发细胞凋亡。结论:通过联合藻蓝蛋白,可以显著降低全反式维甲酸的使用剂量从而降低毒副作用。全反式维甲酸和藻蓝蛋白联合用药抑制HeLa细胞生长的分子机制可能是通过抑制CDK-4和bcl-2的表达来影响细胞周期并最终导致细胞凋亡。     

人乳寡糖2′-岩藻糖基乳糖的功能及其全细胞生物合成

母乳是新生儿最理想的营养剂。其中,人乳寡糖作为母乳的第三大固体组分,对新生儿的生长、发育及健康状况有重要影响,被应用于婴幼儿配方食品中。2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL),是分泌型母乳中含量最高的人乳寡糖,约占人乳寡糖总量的30%,具有重要的营养和医学价值。2′-FL能够促进婴幼儿生长发育、提高其认知能力、增强免疫力、抗过敏、抗病毒,以及调节肠道菌群,是极具潜力的新型营养强化剂。但是,2′-FL来源于母乳,依靠分离、提取获得大量2′-FL并不现实,因此亟需进行人工合成。人工合成2′-FL的方法有3种,包括：化学合成法、酶催化合成法和全细胞生物合成法。全细胞生物合成法因其成本相对低廉,且易于规模化扩大,而引起了国内外的广泛关注和研究。目前,国外很多跨国公司均开始布局2′-FL的工业化生产和应用,而我国在该领域尚处于研发阶段,因此,了解和掌握2′-FL的合成方法对我国开展2′-FL规模化生产具有重要的意义。本文旨在介绍2′-FL的功能特性,系统阐述其全细胞生物合成的关键技术和最新进展,讨论了针对限速步骤进一步提高产量的策略,旨在为2′-FL的合成和商业化生...     

全反式维甲酸通过γ-氨基丁酸途径促进小鼠胚胎腭板间充质细胞的凋亡

维甲酸(RA)是一种能够诱导腭裂发生的致畸物．研究显示γ-氨基丁酸(GABA)在腭板的发育过程中发挥重要作用．而GABA是否参与了RA诱导的腭裂发生还不清楚．本研究以小鼠胚胎腭板间充质细胞(MEPM)为研究对象,观察全反式维甲酸(atRA)(0.2、0.67、2.0和 6.7 μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响,并探讨GABA信号通路在其中的可能作用．结果显示,atRA(2.0 μmol/L和6.7 μmol/L)显著性抑制了MEPM的增殖,并促进了细胞凋亡．atRA(0.67、2.0和 6.7 μmol/L)显著性降低了GABA合成的关键酶谷氨酸脱羧酶(GAD67)mRNA和蛋白质的表达,但对γ-氨基丁酸A型受体-β3(GABAAR-β3)mRNA和蛋白质的表达没有影响．1.0 μmol/L的GABA逆转了atRA(6.7 μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响．以上结果表明,atRA通过下调GAD67的表达,减少GABA的产生,抑制MEPM的增殖和促进MEPM的凋亡,从而可能影响腭板的发育,诱导腭裂形成．     

全反式维甲酸对SD大鼠系膜细胞株增殖和Ⅳ型胶原的影响

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖及Ⅳ型胶原的影响.方法:以高糖(葡萄糖浓度为25mmol.1-1)刺激体外培养的大鼠MCs增殖,然后根据实验分组加入不同浓度的ATRA:对照组:5.6mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基;实验组:25 mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基+不同浓度的ATRA(分别为0 mol.1-1、10-8 mol.1-1、10-7mol.1-1、10-6mol.1-1,采用MTT比色法观察12、24、48h系膜细胞的增殖情况;Elisa法测定12、24、48h细胞上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果:ATRA有抑制高糖所致的MCs增殖、减少细胞外基质(ECM)的作用,并呈剂量时间依赖性.结论:ATRA对高糖所致MCs增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性.     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

全反式维甲酸对哮喘模型大鼠Th1/Th2平衡的影响

[目的]观察不同剂量全反式维甲酸(All-trans retinoid acid, ATRA)对哮喘模型大鼠Th1/Th2平衡的影响。[方法]将SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。对照组和模型组的大鼠给予生理盐水(10 mL/kg)灌胃,对低/中/高剂量组的大鼠,分别给予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg ATRA灌胃,1次/d,持续1 w。观察各组大鼠的肺功能、肺组织匀浆液细胞因子水平、血Th1/Th2值及Notch通路的表达情况。[结果]中/高剂量组大鼠呼吸频率显著低于模型组(P<0.05);吸气流量、呼气峰流量和潮气量显著高于模型组(P<0.05);模型组、低/中/高剂量组肺组织匀浆液中的IgE、IL-4和IL-5水平依次降低,IFN-γ和IL-12水平依次升高;模型组Th1/Th2值显著高于对照组(P<0.05),ATRA治疗后Th1/Th2值较模型组均显著降低,剂量越高Th1/Th2值降低越明显;与对照组相比,模型组、低/中/高剂量组的Notch3、Delta1、Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白表达水...     

α1，2-岩藻糖转移酶基因转染对卵巢癌细胞生物学行为的影响

为探讨α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyhransferase,α1,2-FT）基因转染对卵巢癌细胞RMG—I生物学特性的影响．利用PCR方法克隆人α1,2-FT基因的编码区HFUT—H,构建表达载体pcDNA3．1-HFUT—H．利用磷酸钙法将其转染入卵巢癌细胞系RMG—I,建立α1,2-FT基因稳定高表达细胞株RMG—I—H。采用RT—PCR及α1,2-FT活性测定检测转染前后细胞系α1,2-FT基因表达及α1,2-FT活性的变化,利用免疫细胞化学方法测定细胞表面Lewis y抗原表达变化,利用MTT法、流式细胞仪细胞增殖周期检测方法测定转染前后细胞系生物学特性的变化。分别以转染前细胞RMG—I和转染空载体细胞RMG—I-C为对照组。结果显示转染后细胞α1,2-FT mRNA表达增高,α1,2-FT活性增加20—30倍。转染后的细胞易复层生长,生长速度加快,细胞克隆边缘呈树突状延伸生长。转染后细胞RMG—I—H软琼脂克隆形成率（35％）明显高于对照组RMG—I（13％）及RMG—I—C（12％）,为对照组的2．6倍。RMG—I—H细胞G1期比例从对照组的74．14％下降到59．46％,G2-M期和S期比例分别从对照组的2．05％和23．95％上升到7.32％和33．27％（P〈0．05）。这些结果充分说明。α1,2-FT及Lewisv抗原具有促进RMG—I细胞增殖,提高RMG—I细胞生存能力,促进肿瘤发生、发展的作用。     

唾液酸转移酶对肿瘤中唾液酸化结构的影响

随着侵袭能力的增强,肿瘤细胞表面经常会出现唾液酸化糖链结构的增加。现在已经证实许多特殊的唾液酸化结构,如TF类抗原、sLew类抗原、α2-6唾液酸化的乳糖胺结构、PSA结构、神经节苷脂结构都参与细胞间的相互作用。本文综述了与肿瘤相关的特殊的唾液酸化结构的改变与相应的唾液酸转移酶在其中发挥的作用。