Qβ复制酶与RNA重组技术

以往的遗传工程主要是设计生物的基因蓝图,转移DNA的过程,其关键是DNA的重组操作.自1983年哥伦比亚大学的Kramer,Mills和Miele建立RNA重组技术以后,人们认为遗传工程的内容必将极大地丰富起来. 一、Qβ复制酶和MPV-1 RNA RNA重组技术是在需求大量RNA的刺激下发展起来的.细胞内的RNA是DNA的转录产物,而转录要求一定的条件,进行的规模也很有限。即使在转录活跃的情况下,一个DNA分子一次产生一个RNA分子,RNA分子的量只能按算术级数增长.因此要想得到足     

R环的形成及对基因组稳定性的影响

R-环是由一个RNA:DNA杂交体和一条单链状态的DNA分子共同组成的三链核酸结构。其中, RNA:DNA杂交体的形成起因于基因转录所合成的RNA分子不能与模板分开, 或RNA分子重新与一段双链DNA分子中的一条链杂交。在基因转录过程中, 当转录泡遇到富含G碱基的非模板链区或位于某些与人类疾病有关的三核苷酸卫星DNA时, 转录泡后方累积的负超螺旋可促进R环形成。同时, 新生RNA分子未被及时加工、成熟或未被快速转运到细胞质等因素也会催生R环。研究表明, 细胞拥有多种管理R环的方法, 可以有效地管理R环的形成和处理已经形成的R环, 以尽量避免R环对DNA复制、基因突变和同源重组产生不利影响。文章重点分析了R-环的形成机制及R环对DNA复制、基因突变和同源重组的影响, 并针对R-环诱导的DNA复制在某些三核苷酸重复扩增有关的神经肌肉退行性疾病发生过程中的作用进行了分析和讨论。     

外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象

外源性导入哺乳动物细胞的双链DNA会经历重组、重排及其他复杂的分子生化反应。极少数DNA分子会随机整合到宿主基因组,即发生水平基因转移。然而,目前还不清楚这些外源性DNA分子在不含有特殊启动子的情况下是否能被细胞的转录机器识别并起始转录。在构建环状RNA(circ RNA)表达体系的过程中,发现了外源性DNA分子能经历不依赖启动子的转录,而且转录本会发生符合"GU-AG"法则的RNA剪接进而产生类似于环状RNA的异常剪接分子。进一步研究表明,外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象是保守的。揭示了外源DNA在哺乳动物细胞中的一个新的命运途径,该发现对研究外源性DNA对宿主细胞的影响具有重要意义及应用价值。     

重组RNA技术

重组DNA技术已成为生物工程的重要支柱。利用这一技术人们已经开始以工业的规模生产对人类有重要意义的蛋白质。但目前应用重组DNA技术还存在一些难以解决的困难:生产成本昂贵;某些产品的安全性存在一些问题;真核重组DNA分子在现有转录系统中难以表达或表达效率不够理想。然而近年来出现的重组RNA技术将会避免重组DNA技术应用上存在的问题。具有区别于重组DNA突出的特点。     

重组RNA技术的诞生

重组RNA技术,是美国哥伦比亚大学癌症研究所Kramer、Mills和Mide三人合作发明的。1984年初,哥伦比亚大学科技发展办公室已为该项技术申请专利。重组RNA技术的诞生意味着分子生物学在继重组DNA技术之后,又进入一个新的发展阶段。过去,人们只能在试管中利用DNA模板,RNA多聚酶及其辅因子很困难地转录出少量RNA,应用重组RNA技术,用100毫微克的RNA模板在一小时内就能复制出一毫克的RNA。重组RNA技术的关键所在是Qβ复制酶,它是1965年从被Qβ细菌病毒感染的寄主细胞中发现的一种RNA复制酶。当QβRNA侵入寄主细胞,能编码三种蛋白质:外壳蛋白、     

遗传工程的成就和展望

遗传工程一般是指将外源基因与DNA载体结合,形成重组DNA,然后引入到受体细胞,使外源基因复制并产生相应基因产物的技术,亦称为基因工程或重组DNA技术。也有人把细胞融合和染色体工程包括在遗传工程的范畴之内。 五十年代和六十年代分子遗传学的蓬勃发展,使人们搞清了基因的本质以及遗传信息复制和传递的机制,再加上七十年代初限制性内切酶的发现,基因分离技术的进展和细胞转化方法的建立,使遗传工程这门定向改造生物的新技术应运而生。1973年,Cohen等使大肠杆菌的抗四环素质粒和抗链霉素质粒在试管中重组,并在大肠杆菌中表达,进行了第一项遗传工程实验。     

重组DNA技术

重组DNA(recombihant DNA),顾名思义,即将两种不同的DNA分子,经过裁剪并重新组合,创造出一种新的、杂合的DNA分子,然后将它转化或转导至受体细胞并在其中进行复制以及表达。这一技术通常叫作基因工程,广义来讲也称为遗传工程。1972年,美国生物化学家P.Berg等人首先将XDNA上剪切下来的一段基因,成功地拼接到SV_(40)病毒DNA分子上,从而开创了这一崭新的技术。随后,这一技术在现代生物学的研究和     

Berg对重组DNA研究的述评

美国斯坦福大学生化学家Paul Berg是重组DNA研究的开创人。七十年代早期,他与同事们构建了第一个重组DNA分子。由于这一工作获得了1980年化学诺贝尔奖。Berg所从事的遗传化学工作,如今仍在继续,并获得不小的成就。最近,他接受了《C&EN》刊物的采访。谈到由于DNA重组技术所导致的分子生物学有关 进展,进一步研究方向,以及过去和目前,有关遗传工程的看法。现发表如下。     

细菌与遗传工程

遗传工程又称“遗传操作”,有广义和狭义之说。广义的遗传工程指把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的细胞中去,并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。狭义的遗传工程又称基因工程或重组DNA技术,这是从供体生物提取所需基因,也就是DNA片段,与载体重组后引入受体生物,从而改变受体     

DNA的化学合成及其应用

通过二十多年的探索和研究,脱氧核糖寡核苷酸(DNA)片段的化学合成得到了突飞猛进的发展。DNA固相合成技术的问世更使DNA化学合成技术达到了精确、高效和自动化。重组DNA技术以及外源DNA分子在异源体系中的表达为DNA结构功能及基因表达调控机制的研究打开了新局面,使得生物学的研究发生了革命性的变化,而DNA分子的化学合成为分子生物学家对特定的基因进行遗传工程的操作,选择性地对DNA分子进行改造提供了崭新的手段。借助于化学合成的DNA片段,人     

生物工程技术讲座[八]

应用微细胞检测基因产物的方法由于质粒和噬菌体等的DAN分子能在细胞内进行自我复制,以及DNA重组技术的普及,质粒DNA做为异源性DNA分子的载体,在基因工程中目前已被广泛应用。在克隆或分析真核生物或原核生物的多种不同基因时,常用检测基因表达来确定其存在。把含有某一目的基因的DNA片段和载体质粒的DNA进行重组,再通过重组DNA在受体细胞中的转录、翻译、     

大规模合成长链RNA的简易低成本工艺

由于现有技术所限,RNA分子长度和二级结构往往成为RNA合成困难的主要原因.提供了一种简单低成本大规模制备和纯化长链RNA药物的新工艺,尤其针对具有稳定二级结构的长链RNA药物.采用引物延伸方法替代PCR和线性质粒DNA方法制备线性DNA模板可减少步骤及降低污染,然后用T7 RNA聚合酶转录制备的甲氧基修饰的线性DNA模板获得高均一度的长链RNA,转录粗产物直接用source 15Q阴离子HPLC分离T7 RNA聚合酶、rNTP、转录中断产物、内毒素和模板DNA等,从而获得高纯度RNA终产物.该工艺无需繁琐的酚/氯仿抽提和RNA变性,尤其适用于RNA的大量制备.     

《生物工程讲座》(Ⅲ) ——基因工程的理论及应用(二)重组DNA技术和基因工程

DNA双螺旋模型的提出意味着分子生物学的诞生,重组DNA技术的建立标志着遗传工程和生物工程的问世。可以说重组DNA技术对整个生物学研究的影响比起DNA双螺旋来说有过之而无不及。目前世界上从事生物学或医学研究的大多数实验室都在使用这项技术解决不同的生物学问题。许多人衡量一个生物学实验室是否先进总喜欢把是否运用重组DNA技术和基因工程作为一个重要标志。一、重组DNA技术和基因工程概况重组DNA技术和基因工程涉及的内容很广,不仅包括外源DNA和载体的重组,还应     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

酶学方法第68卷(重组DNA)

本书介绍研究遗传工程、分子生物学方面很重要的重组DNA的研究方法及最新技术。内容包括重组DNA技术,用于重组DNA研究的酶学,DNA的合成、分离与提纯,用于重组DNA无性繁殖的载体和宿主,DNA无性繁殖系的筛选,无性繁殖基因表达的检验与分析方法。     

遗传工程

生物把各种性状从父代传给子代的现象就是遗传。遗传工程是一门人工改造生物遗传性的新的科学技术。人们根据需要,有计划地将不同生物的遗传物质,有选择地提取出来,在体外进行切割和分子水平的人工重组,然后再把重组的 DNA分子转移到不同的生物细胞中,使生物的     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

遗传工程十年累积索引(续)

从美日两国生物工程研究现状看日本的未来发展遗传工程85年1期1页一九八四年基因工程研究在我国获得十项主要成果柯为遗传工程85年1期页美国植物分子遗传和遗传工程研究情况简介一访美见闻遗传工程85年1期5页建立抗菌素基因克隆遗传工程85年1期12页重组疫苗预防乙型肝炎遗传工程85年1期n页DNA序列的直接查检法遗传工程85年1期14页基因异常和染色体结构遗传工程85年1期14页遗传工程在食品工业上的应用遗传工程85年1期15页食品工业用酶的克隆遗传工程85年1期14页分子克隆链霉菌抗生素生物合成的整个途径以及它们在异源寄主中的表达遗传工程8…     

pRNA导入型Ribozyme的设计和体外转录制备

目的:枯草杆菌的包装RNA分子pRNA是新型纳米分子载体,将其同锤头型核酶Ribozyme重组可以构建结构稳定、能进入细胞、主动识别结合和剪切基因RNA的pRNA-Ribozyme.由于目前100 nt以上的RNA分子采用化学合成制备较为困难,实验采用基因重组构建并体外转录制备170 nt的pRNA-Ribozyme....     

准备进行大田试验的重组DNA植物

公司Cib一Geigy生物技木研究公司Mosanto农业公司Mosanto农业公司北卡罗林纳州立大学弗洛里达大学Mosanto农业公司Rohm&Haas公司Poimeer Hi一Bre迁国际公司美国农业部农业研究局Calgene公司 试验内容- 重组DNA玉米/引进混霉素(hygromy-c认)抗性和任葡糖昔酸酶标记基因 通过遗传工程表达苏云金杆菌(Bt(ssp.)Kurstaki)色一内毒素蛋白质的重组DNA玉米 通过遗传工程表达苏云金杆菌(Bt(ssp.)Kurstaki)各一内毒素蛋白质的重组DNA棉花-通过遗传工程表达苏云金杆菌Kurslakl两种HDI菌株卜内毒素蛋白质的重组DNA花草重组DNA花草/引进表…