人骨髓间充质干细胞移植对食蟹猴脑出血模型损伤的修复作用

目的观察人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）移植4周和8周后,对食蟹猴脑出血模型脑组织损伤的修复作用。方法在脑定位仪定位下,通过自体血注入法制成食蟹猴脑出血模型,并将其随机分为高剂量治疗组、低剂量治疗组和模型组,分别在脑出血部位附近注入高、低密度的hMSCs和生理盐水。应用整体病理切片扫描、HE染色及免疫组织化学的方法观察hMSCs移植治疗食蟹猴脑出血4周和8周后脑损伤部位的病理变化。结果脑出血模型组可见脑出血损伤部位脑组织大面积变性坏死,多量吞噬含铁血黄素的泡沫细胞增生,周围少许肉芽组织增生伴局部纤维组织形成。hMSCs治疗组,整体切片扫描结果提示,与模型组相比,hMSCs低剂量及高剂量治疗组均可见脑组织变性坏死范围减小,且低剂量治疗组略好于高剂量治疗组;HE染色可见大脑注射部位局部脑组织变性坏死、吞噬含铁血黄素的泡沫细胞增生,周围肉芽组织增生伴局部纤维组织形成。免疫组化发现治疗组出血区内可见神经巢蛋白（Nestin）阳性细胞内散在分布,而在模型组中呈阴性表达。结论hMSCs可促进食蟹猴脑出血脑组织损伤的修复,且治疗效果可能与治疗剂量有一定相关性。     

人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血的治疗作用

目的评价人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血模型的治疗作用。方法符合普通级标准的成年食蟹猴12只,用自体股动脉抗凝血脑内注射方法建模后1周,用脑立体定位法在血肿周围植入人骨髓间充质干细胞,细胞数分别为高剂量5×106、低剂量1×106、对照组等体积生理盐水。利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对干细胞移植效果进行评价。结果神经功能评分显示干细胞移植1周后动物神经功能明显改善。PET结果显示干细胞移植后2周高剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间存在显著性差异(P=0.02)。移植后3周高、低剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间差异存在显著性(P值分别为0.03和0.04)。MRI显示剂量组血肿吸收速度大于对照组。病理检查可见剂量组坏死灶面积小于对照组,出血灶周围有大量新生血管生成,剂量组与对照组间差异存在显著性(P<0.01)。结论在损伤脑组织周围移植hBMSC可促进食蟹猴损伤神经组织的恢复,为hBMSC治疗脑出血的临床应用提供了重要实验依据。     

慢病毒载体感染成年食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有增殖和多向分化潜能,临床应用广泛,近年来备受关注。另一方面,MSCs易于转导和表达外源基因,是理想的基因工程细胞。非人灵长类(NHPs)和人类具有非常相近的遗传背景,NHPs模型在评价药物疗效和移植治疗等方面具有不可替代的价值。本研究采用密度梯度离心法分离成年食蟹猴骨髓单核细胞(Marrow mononuclear cells,MNCs),贴壁培养MSCs。同时构建表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体,感染成年食蟹猴MSCs。结果显示,体外培养的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒(Simian foamy virus,SFV),体外培养成年食蟹猴MSCs必须添加抗病毒药物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV,以及培养中添加了抗病毒药物Tenofovir,慢病毒载体的感染效率明显降低(10%)。本研究通过停用抗病毒药,在细胞复苏后6d转染慢病毒,可大幅提高慢病毒的感染效率(50%)。为成年食蟹猴MSCs作为基因工程细胞应用于实验和临床研究提供了技术保证。     

对比不同年龄段食蟹猴骨髓间充质干细胞的生物学特征

骨髓间充质干细胞因其广泛的临床应用前景而备受关注.非人灵长类动物在基因、生理和代谢等方面与人类相似,在制作疾病模型和疾病治疗研究等方面具有无可比拟的优势.因此,来源于非人灵长类的骨髓间充质干细胞是细胞移植和组织工程研究中的重要工具.本实验对比研究了不同年龄段食蟹猴骨髓间充质干细胞的生物学特征.结果发现,与中年食蟹猴骨髓间充质干细胞比较,青少年食蟹猴骨髓间充质干细胞具有明显高的增殖和分化潜能.长期体外培养的食蟹猴骨髓间充质干细胞能发生自发转变,转变后的细胞具有明显不同于骨髓间充质干细胞的形态特征.端粒酶活性检测显示,各年龄组不同代数的骨髓间充质干细胞端粒酶活性没有明显差别,但与骨髓间充质干细胞比较,转变后的细胞端粒酶活性显著增高.另一方面,随着体外培养时间延长,染色体不稳定性发生频率相应增加.这些结果提示在使用间充质干细胞进行实验或临床研究前,必须全面考虑各种因素,包括供体的年龄等,并且完善各种检测.     

GDNF慢病毒载体感染食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是基因工程和细胞治疗的种子细胞之一,本研究利用含胶质源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体感染成年食蟹猴MSCs,探讨转染后GDNF在MSCs中的体外表达水平及其影响因素。首先,通过密度梯度离心法分离食蟹猴骨髓单核细胞(marrow mononuclear cells,MNCs),体外培养食蟹猴MSCs。同时构建表达GDNF的慢病毒载体,并感染食蟹猴MSCs,分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法,测定感染不同拷贝数病毒和不同转染组细胞GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验结果显示,表达GDNF基因的慢病毒载体成功转染成年食蟹MSCs,体外培养的MSCs持续表达分泌GDNF。感染慢病毒的拷贝数可以影响GDNF分泌水平,相同条件下感染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。     

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。     

上肢精准测试系统在食蟹猴脑缺血研究中的应用

目的使用上肢精准测试系统对脊髓间充质干细胞治疗脑缺血的疗效进行行为学分析评价。方法成年食蟹猴18只,手术前2个月用上肢精准测试系统对动物进行训练并采集本底数据。采用光化学法制作局部脑缺血模型,造模后4周将动物随机分为对照组、干细胞治疗高剂量组和低剂量组,分别在缺血灶周围注射生理盐水、脊髓间充质干细胞5×106/只和1×106/只,造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干细胞注射后1d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周采集行为学实验数据。比较造模前后和干细胞注射前后动物受损伤侧上肢抓取水果块的时间,结合神经功能评分评价造模和干细胞治疗效果。结果 18只动物手术后均出现与梗死部位对应的行为学症状。在术后采集数据的各个时间点损伤侧上肢行为学数据与手术前差异均存在极显著性（P〈0.01）。神经功能评分术后24 h最高,随后出现渐进性恢复。干细胞治疗后3 d到治疗后第8周,模型组动物与高、低剂量组动物间精准上肢运动测试结果差异均存在显著性（P〈0.05）。神经功能评分在治疗2周后出现显著性差异（P〈0.05）。高、低剂量组间差异未见显著性。结论上肢精准测试系统能客观准确的反应动物神经功能,在非人灵长类脑卒中动物模型建立和药效学评价方面有广泛应用前景。     

骨髓间充质干细胞过表达IL-10基因对脓毒症的治疗作用

脓毒症是近年来的医学难题之一,迫切需要探讨新的治疗手段．以往研究发现,骨髓间充质干细胞具有免疫调节作用,免疫细胞因子白介素10(IL-10)是细胞因子分泌的抑制因子,具有很好的抗炎作用．因此构建了携带小鼠IL-10(mIL-10)的腺病毒载体,用它来感染骨髓间充质干细胞(BMSC),并通过载体上的绿色荧光蛋白来筛选过表达mIL-10基因的骨髓间充质干细胞(BMSC-mIL-10)．随后,运用盲肠结扎穿孔法在小鼠体内建立脓毒症模型,并观察BMSC-mIL-10在脓毒症中的治疗作用．研究发现,和单纯BMSC治疗组相比,BMSC-mIL-10可以明显降低脓毒症老鼠体内炎症因子的产生,这包括TNF-α、IL-6、IL-1α和 IL-1β等,同时,BMSC-mIL-10治疗组小鼠的肺部和肾脏炎症反应减轻,体重丢失下降,死亡率明显降低．为进一步探讨BMSC-mIL-10治疗机制,运用Western blot和免疫荧光染色方法发现BMSC-mIL-10组上清液可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞中LPS引起的NF-κB的激活．上述结果表明,骨髓间充质干细胞过表达IL-10有望成为脓毒症治疗的潜在手段之一．     

菲立磁标记食蟹猴骨髓间充质干细胞的脑内移植示踪研究

中枢神经系统损伤后的再生修复问题一直是神经科学领域关注的重点之一,骨髓间充质干细胞移植治疗拓宽了人类中枢神经系统损伤的治疗前景,而非侵入性的磁共振成像能活体追踪移植细胞,评价移植效果。应用菲立磁标记食蟹猴骨髓来源的间充质干细胞,在脑立体定位仪引导下,自体脑内移植。结果显示,菲立磁标记间充质干细胞的有效率高达90%以上,移植区磁共振影像呈明显的低信号改变。标记的间充质干细胞移植后在脑内存活,并向周围的脑实质内迁移。移植8周后,发现移植细胞通过血管向对侧脑部迁移,但并未发现移植细胞向神经细胞分化。这些结果提示,菲立磁可用于标记、追踪脑内移植的食蟹猴骨髓间充质干细胞,标记的移植细胞可在脑内存活、迁移。     

多模式追踪食蟹猴骨髓间充质干细胞

近年来, 在细胞治疗和再生医学领域, 自体或异体细胞移植治疗疾病正在成为现实. 骨髓间充质干细胞具有分化成多种细胞的潜能, 已被广泛用于各种疾病的研究和治疗. 活体追踪移植细胞, 检测移植细胞的生存及功能状态对于评价移植治疗效果至关重要. 目前, 利用磁共振对比剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO), 活体追踪和监测标记细胞已被广泛用于动物实验研究和一些临床疾病诊断. 但 MRI 信号不能显示移植细胞在体内的生物学特征. 本研究中, 对食蟹猴骨髓间充质干细胞体外标记Molday ION rhodamine-B^TM(MIRB), 探讨MIRB 标记后cMSCs 的细胞生物学特性, 以及脑内移植后的活体MRI 影像学及组织学追踪. 结果表明, MIRB 具有生物组织相容性, 能高效标记cMSCs, 可用于体内多模式追踪移植细胞, 为利用MIRB 追踪和检测移植细胞, 以及干细胞移植治疗机制的研究提供资料.     

骨髓间质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注凋亡蛋白Caspase-3的影响

目的研究静脉移植骨髓间充质干细胞（MSCs）对脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及凋亡相关蛋白caspase-3的影响。方法体外培养及扩增MSCs后,用绿色荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记,通过静脉途径移植给大脑中动脉缺血2 h再灌注的SD大鼠,按不同时间点取材,荧光显微镜观察BMSCs在脑内的分布,免疫组织化学染色及RT-PCR检测大鼠脑内caspase-3蛋白表达情况。结果移植组在移植后第6天神经功能明显好于对照组（P〈0.05）。移植组移植后3、12、24、48、72 h caspase 3免疫组化阳性目标面密度分别为（1.34±0.31）%、（3.98±0.67）%、（5.58±0.92）%、（4.65±0.69）%、（3.51±0.63）%,对照组分别为（2.09±0.19）%、（5.23±0.30）%、（6.89±0.57）%、（5.93±0.56）%、（4.39±0.57）%,移植组和对照组比较均（P〈0.05）。6h及7 d移植组caspase 3阳性目标面密度分别为（2.81±0.35）%、（1.64±0.29）%,与对照组（3.92±0.44）%,（2.29±0.21）%比较差异显著（P〈0.01）。移植组相应时间点caspase-3的表达明显低于对照组（P〈0.05,P〈0.01）;移植组大鼠缺血侧皮层的caspase-3 mRNA相对量明显低于对照组（P〈0.01）。结论经静脉注射骨髓间充质干细胞可明显改善神经功能。其可能通过下调caspase-3表达方式对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

软骨细胞上清液诱导冻存复苏后人骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨人软骨细胞培养上清诱导冻存人骨髓充质干细胞向软骨细胞分化的可行性.方法:取进行全髋关节置换术老年患者的骨髓和软骨组织,利用密度梯度离心法、全骨髓培养法分别培养骨髓间充质干细胞,冻存备用.培养软骨细胞,观察细胞生长,收集软骨细胞培养上清.复苏冻存的人骨髓间充质干细胞,观察复苏后细胞生长状态.利用收集的软骨细胞培养上清对复苏间充质干细胞进行定向诱导,诱导培养2周,观察细胞外观表型变化,Ⅱ型胶原免疫组化检测诱导后人骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达.结果:密度梯度离心法与全骨髓培养法均可分离获得人骨髓间充质干细胞,原代生长前者优于后者.复苏细胞仍进行可传代,与正常生长骨髓间充质细胞无明显差异,均可传至第8代.软骨细胞培养上清诱导2周后,细胞形状向圆形,多角形转变,冻存骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性.结论:老年人骨髓间充质干细胞仍具有向软骨细胞转化的能力,冻存不影响其转化能力.     

骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响,并对其相关机制进行探讨。方法:90只大鼠随机分为3组:假手术组、对照组、BMSC移植组,每组30只。对照组和BMSC移植组建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,假手术组只需要分离大鼠颈部组织,而不造MCAO模型。BMSC移植组在MCAO模型术后1天经尾静脉注射1 mL/3×10~6 BMSC,对照组注射同剂量的生理盐水,于MCAO术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d分别对各组大鼠进行神经功能评分(mNSS),术后2个月对BMSC移植组及对照组大鼠脑组织进行免疫组化染色,检测MAP2、TUJ1、Ⅷ因子、GFAP的表达情况。结果:在治疗后的第7天至第35天,BMSC移植组mNSS均显著低于对照组(P0.05)。术后2个月,BMSC移植组MAP2、TUJ1、Ⅷ因子表达量显著高于对照组,而GFAP表达量显著低于于BMSC对照组(P0.01)。结论:BMSC移植可以促进脑梗死神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞免疫抑制作用及其机理

近年来间充质干细胞特殊的免疫学特性越来越引起人们的重视,使其成为移植领域的一个研究热点。许多实验室就间充质干细胞的免疫抑制作用和机理做了大量的研究工作,取得了一定的进展。本文简要综述间充质干细胞的免疫抑制作用和机理。     

阿司匹林对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的影响研究进展

阿司匹林是缺血性脑卒中患者急性期治疗药物及卒中再发的二级预防常用药物,骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植是治疗缺血性脑血管疾病的新的新兴技术。已证实阿司匹林可抑制骨髓间充质干细胞的增殖及影响骨髓间充质干细胞的分化。本文就阿司匹林对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的影响等进行综述。     

人骨髓间充质干细胞培养方法

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一种多潜能的成体干细胞,在细胞治疗和组织工程上具有广阔的应用前景。对供体年龄、分离方法、培养密度、培养基和培养基质表面性质对细胞增殖的影响进行了比较,重点阐述了用人自体血清结合多种细胞因子,替代胎牛血清培养BMMSCs的效果,转染端粒酶基因的BMMSCs的增殖能力和分化潜能,以及灌注培养反应器用于大规模培养的技术进展。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝损伤的实验研究

目的:了解肝损伤大鼠在输注骨髓间充质干细胞后肝功能生化指标和肝脏组织病理变化情况,为临床应用提供实验依据。方法:将大鼠随机分为正常组和造模组。造模组采用腹腔注射四氯化碳的方法构建,然后将造模组随机分为干细胞移植治疗组、模型对照组。干细胞移植组经门静脉输注标记的骨髓间充质干细胞。3周后处死大鼠。然后检测大鼠肝功能、肝脏病理改变分析干细胞移植治疗肝损伤效果。结果:干细胞移植治疗3周后,大鼠的肝脏与对照组比较,明显恢复,但是并没有恢复到正常水平。结论:骨髓间充质干细胞对肝损伤的大鼠有治疗作用。     

携带白介素-18基因的人脐带间充质干细胞的构建及其意义

目的：构建携带白介素-18（IL-18）基因人脐带间充质干细胞（hUMSCs）,为肿瘤靶向性基因治疗研究提供一种工具。方法：体外分离培养hUMSCs,流式细胞仪（FACS）检测hUMSCs 的细胞免疫表型。应用基因重组技术将表达IL-18 基因的慢病毒转染至hUMSCs,利用RT-PCR 及Western blot 法检测IL-18 的蛋白mRNA表达水平。结果：成功在体外分离和培养了hUMSCs,流式细胞仪检测结果显示hUMSCs 表达CD29、CD44 和CD105,而不表达CD34 和CD45, 符合hUMSCs 的表型。成功构建携带IL-18 基因的hUMSCs,RT-PCR 及Western blot法检测结果提示IL-18基因转染至hUMSCs并能稳定表达。结论：构建携带IL-18基因的hUMSCs并稳定表达IL-18,为肿瘤靶向性基因治疗实验性研究提供了一种新实验工具。