猴源细小病毒血凝和血凝抑制试验的优化与应用

目的优化猴源细小病毒的血凝和血凝抑制（HA/HI）试验条件,以优化的方法对160份2010年～2011年间采集于中国北京地区圈养猴群的血清样品进行猴源细小病毒抗体调查。方法 在不同的缓冲液、缓冲液pH值、猪红细胞浓度、兔血清浓度、阿氏液比例和温度下进行猴源细小病毒的HA/HI试验,选择合适的HA/HI条件。通过优化的HA/HI方法对160份猴血清进行猴源细小病毒抗体检测。结果pH 7.0、0.02 mol/L PBS、0.75%猪红细胞、0.5%兔血清和4℃可作为猴源细小病毒HA/HI试验合适的反应条件,猪血球以1∶1阿氏液抗凝,可保存5～7 d不影响实验结果。猴血清的猴源细小病毒抗体阳性率为58.1%。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。细小病毒在我国北京地区圈养猴群中感染比较普遍。     

犬细小病毒单克隆抗体的制备及其与免疫血清在血凝抑制中的比较

将用犬细小病毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下融合,经筛选、克隆,得到６株稳定分泌犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤。用杂交瘤腹水作血凝抑制试验,检测分别含有犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒和水貂肠炎病毒的标本,及ＣＰＶ感染犬粪便标本,并与免疫血清作对比。结果表明,用单克隆抗体作血凝抑制试验,比用免疫血清作具有特异性高、操作简便省时等优点,而二者敏感性一致。     

用反向被动血凝及血凝抑制方法检测流行性出血热病毒抗原和抗体

本文建立了检测流行性出血热病毒(EHFV)液体抗原及抗体的反向被动血凝(RPHA)和血凝抑制(RPHI)方法,RPHA检测EHFV抗原的敏感性与ELISA相近;RPHI检测EHFV抗体与IFA的符合率为97.3％,敏感性略低。     

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg^2 离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为：96℃180s,96℃230s,56℃30s,72℃280s,30个循环。联合PCR结果显示：CAV—l扩增片段大小为497bp,CAV-2为l019hp,CPV为719hp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明。联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA／HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA／HI试验。以上结果说明：CAV-1／12AV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2．5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒。因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。     

犬细小病毒诊断与防制研究进展

犬细小病毒是严重危害野生动物驯养繁殖产业的重要病毒性传染病之一,具有感染高、发病急、病程短和死亡率高等特点,且随着病毒的不断变异,其宿主范围不断扩大,除感染狐狸、犬、狼等犬科动物外,还能感染猫、豹、熊、虎和果子狸等其它多种动物,对我国的野生动物保护、驯养繁殖和疫源疫病监测工作的影响越来越大。本文对犬细小病毒的诊断及其防制进行了概述,以期为野生动物感染犬细小病毒的防控提供科学依据。     

犬细小病毒:从起源到进化

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV-2)首次分离于1978年,被认为是由遗传关系相近的猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)或其他肉食兽细小病毒(FPLV-like virus)跨宿主感染犬产生的新病原.其感染能引起新生犬急性心肌炎或幼犬出血性肠炎,造成较高的发病率和死亡率.该病原爆发后短短一年时间内即广泛流行到世界各地.随着CPV-2对宿主的适应和变异,新抗原变异型(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2e)不断产生并在世界各地逐步替代了CPV-2的流行.伴随CPV-2抗原变异的同时,其对宿主(犬、猫)嗜性、毒力等生物学特性也随之改变.本文综述了CPV-2过去30多年在世界流行和变异情况,并探讨了基因变异在病毒跨宿主传播中的意义.     

猫肾F81传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法

目的建立在猫肾F81细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法.方法在猫肾F81细胞上感染犬细小病毒,设计特异性引物,用直接原位PCR法在染毒12h,24h,48h细胞片上检测出犬细小病毒,并与常规免疫组化的方法进行了比较.结果在染毒48h的细胞片上,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较,差异极显著(P＜0.001),用原位PCR法所得出的阳性率高.结论原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点.     

虎血清犬腺病毒抗体调查

犬腺病毒（Canine adenovirus,CAV）属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成员,分为犬腺病毒Ⅰ型（CAV-1）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV-2）,其中CAV-1主要引起狐狸（Vulpes vulpes）脑炎和犬（Canis familiaris）传染性肝炎（殷震和刘景华,1997;胡体拉,1963）。在国内,夏咸柱等（1984）首次分离到CAV-1,随后,多个地区的不同动物中又有相继分离到该病毒的报道（钟志宏等,1990;范泉水和袁国庆,1992;夏咸柱等,1984）。CAV-2主要引起犬的喉气管炎和幼犬咳嗽,在我国的感染也比较普遍（范泉水和夏咸柱,1999）。     

Isolation and Identification of Canine Parvovirus Serotype 2a and Its VP2 Protein Expression in Transgenic Tobacco

A strain of canine parvovirus (CPV) was isolated from feces of an ill puppy in an animal hospital in Wuhan, China. It was designated as CPV/WH02/06. This isolate was identified as serotype CPV-2a by the hemagglutination test, CPV Ag detection strip, electron microscopy, and PCR. The vp2 gene was cloned and sequenced and assigned GenBank accession number EU377537. A 1242 bp segment of the 5' region of the vp2 gene was cloned and inserted into the binary vector pBI121 and used for Agrobacterium-mediated tobacco transformation. Transgenic tobacco plants were selected on MS medium supplemented with 100 μg/mL kanamycin and 100 μg/mL timentin. Integration of the vp2 gene into the tobacco genome was confirmed by PCR using T1 progeny plants, and the expression of the VP2 protein was confirmed by Western blotting.     

抗犬细小病毒VP2蛋白单链抗体的制备与中和活性研究

为了减轻鼠源单克隆抗体(McAb)异源性引起的宿主免疫排斥反应,同时克服生产McAb成本高及费时费力等缺点,利用原核表达制备具有抗犬细小病毒(CPV)鼠源抗体可变区基因的单链抗体(single chain antibody fragment,ScFv)。提取实验室前期制备筛选的分泌具有良好中和活性抗CPV VP2蛋白McAb的杂交瘤细胞株总RNA,从反转录cDNA中扩增抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因并克隆到表达载体中,构建重组质粒p OPE101-ScFv;将重组质粒转化大肠杆菌进行诱导表达,通过蛋白免疫印迹(Western blot)实验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)证明,利用大肠杆菌表达系统获得的ScFv具有和CPV特异性结合的能力,且具有中和活性,效价为1:20(0. 028μg/ml),为CPV的临床免疫治疗提供基础。     

Passive Hemagglutination Assays for the Detection of Antibodies to Herpes Viruses

A simple and effective method for the detection of antibodies to herpes simplex virus (HSV), human cytomegalovirus (HCMV) and varicella-zoster virus (VZV), has been established using the passive hemagglutination assay (PHA) in combination with viral specific glycoproteins. The results obtained with the PHA were compared with those from neutralization (NT) and complement fixation (CF) tests. The PHA test for each of the herpes viruses appears to compare favorably with the other assays tested. The specificity and sensitivity of HSV PHA to NT were 100%, whereas the specificity and sensitivity of HSV CF test to NT were 98% and 100%, respectively. For HCMV, the specificity and sensitivity of PHA to NT and PHA to CF were 100%. Similarly, the specificity and sensitivity of VZV PHA to NT were 100%. Because of the low sensitivity of the VZV CF, the sensitivity of CF to NT was 83%. Furthermore, the range of antibody titers and their absolute levels obtained in the PHAs were significantly greater than those in the NT and CF tests.     

表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

对CAV-2的E3区的Ssp I片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAXΔE3,然后将CPV VP2表达盒连接到pVAXΔE3的E3区缺失处,构建了CPV VP2表达盒的转移载体pΔECPV-VP2,用SalI NruI分别对pPoly2-CAV2和pΔECPV-VP2进行双酶切,分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,将含CPV VP2表达盒的SalI NruI片段定向克隆入pPoly2-CAV-2载体,获得了含CPV VP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2。用AscI ClaI对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切,释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组,将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除SalI NruI片段的CAV-2基因组的两个片段混合,利用脂质体介导共转染DK细胞,出现病变,获得重组病毒CAV-2/CPV。并且,从形态学、基因组水平、目的基因的转录及重组病毒的生长特征等方面进行了鉴定。结果证明,CAV-2/CPV具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2/CPV在繁殖的过程中没有对CPV VP2表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录CPV VP2的mRNA。CAV-2/CPV的繁殖速度比野生型CAV-2的繁殖速度慢。     

犬细小病毒VP2亲水性编码区的表达与免疫原性分析

目的：探讨犬细小病毒VP2亲水性编码区的免疫原性,为进一步研究基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法：利用蛋白质分析软件Protean对已克隆的犬细小病毒VP2基因序列进行分析,选择亲水性好、抗原性强的293-520位氨基酸区域（命名为VP2S）作为靶序列,然后以已有VP2序列作为模版通过PCR扩增的方法获得VP2S,将VP2S克隆入pQE-31载体获得pQE-31-VP2S;将pQE-31-VP2S的原核表达产物经Western-blotting确认后免疫小鼠,用血凝抑制试验测定抗体水平。结果：293～520位氨基酸区域的亲水性好、抗原性强;重组质粒pQE-31-VP2S可成功表达大约29KDa的能被CPV抗血清识别的VP2S;VP2S能诱导小鼠产生高滴度的血凝抑制（HI）抗体（25）。结论：VP2S具有较强的免疫原性,能作为基因工程亚单位疫苗进行开发研究。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobiallipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(PorcineKidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(MedianToxicosisDose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57mg/L、18.9mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(CytopathicEffects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制。由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。