地高辛标记反意RNA探针检测脑组织切片生长抑素mRNA

本实验采用含大鼠生长抑素基因的ｐＳＰ６５ｃＤＮＡ质位通过转化至噬菌体内大量扩增,经提取,纯化后,用限制性内切酶进行酶切使质枝线性化,并将其作为模板,用地高辛（ＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎＤｉｇ）作为标记物,体外转录合成生长抑素反意ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）探针。实验动物选用ｗｉｓｔａｒ新生大鼠。冰冻切片,端、间脑切片经杂交前用Ｄｉｇ－ＵＴＰ标记的ｃＲＮＡ探针杂交,杂交后用抗Ｄｉｇ－碱性磷酸酶复合物进行酶联免疫反应。Ｘ－磷酸盐－ＮＢＴ显色。结果显示新生大鼠脑内生长抑素ｍＲＮＡ神经元着紫蓝色。杂交反应物集中于核周的胞浆及短小的突起内。胞核不着色。胞体轮廓清晰,周围背底浅淡。结果表明Ｄｉｇ标记ｃＲＮＡ探针不仅具备非同位素标记探针的优点而且能快速和准确检测组织细胞内ｍＲＮＡ的表达。     

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）ＲＮＡ探针,本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ,即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段;经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌,得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段,用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮伏病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;、同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛素标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛索标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点,具有一定的应用前景。     

SAR与植物转基因沉默的消除

随着转基因技术在各上应用领域的深入和发展,转基因沉默现象已引起越来越多的关注。转基因沉默主要发生在转录或转录后水平,涉及核酸的三种相互作用,即：ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ。这是植物基因表达调控的具体表现之一,也是外源基因插入后生物体的一种自我保护。ＳＡＲ协同转基因进行转化,可以消弱宿主ＤＮＡ对外源基因的不利影响。实验证明,在稳定整合的转基因植物中,ＳＡＲ提高了整体表达水平,并降     

用^32P标记cDNA探针进行核酸斑点杂交检测马铃薯卷叶病毒（PLRV）

利用克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因ｃＤＮＡ,用切口平移法制成＾３２Ｐ标记探针,通过核酸斑点杂交,对马铃薯卷叶病毒ＲＮＡ,提纯的马铃薯卷法病毒和感染ＰＬＲＶ的马铃薯茎、叶、声     

我国脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒JX基因型特异RNA探针及其应用

及时发现脊髓灰质炎（脊灰）野病毒,是消灭脊灰工作中病毒学监测的首要任务。近期我国存在４个脊灰Ⅰ型野病毒基因型,其中Ｐ１／ＣＨＮ－ＪＸ８９和Ｐ１／ＣＨＮ－Ｒ９１为两个主要的流行基因型。在分析了我国大量脊灰野病毒ＶＰ１核酸序列的基础上,选取了１３３８ＪＸ８９病毒ＶＰ１５′端的９６个核苷酸片段（２４８０－２５７５）,经ＰＣＲ扩增,克隆至ｐＵＣ／Ｔ７质粒,线性化后,用Ｔ７ＲＮＡ多聚酶制备ＲＮＡ探针,并将Ｄｉｇ标记物渗入探针分子中。经杂交试验,两个主要基因型病毒全部与此探针呈阳性反应,而其它基因型和疫苗相关病毒均为阴性反应,体现了较好的特异性与敏感性,而且实验结果由核酸序列分析等证实。脊灰野毒探针的应用在国际上尚未见报道,它克服了疫苗探针杂交中容易遗漏野毒株的缺点,直接查出野病毒。这对疫苗株中混有少量野毒株的分离物有重要意义。     

纳米金探针在基因检测中的应用

传统的核酸分析中常采用放射性元素、荧光色素以及酶标记等基因探针,这些探针都存在着一些不足之处。近年来,纳米金探针作为一种新型的基因探针,己引起了广泛的关注。该探针具有优良的光谱特征和光化学稳定性,对核酸的非特异吸附性小,与核酸等生物大分子结合后不改变生物分子的活性。将纳米金探针用于基因检测,具有操作简便、快速、安全、实验成本低等优点。本文就纳米金探针的发展过程、纳米金探针的制备、检测原理及其在基因分析中的应用等几个方面作了系统而全面地概述,同时介绍了纳米金探针的最新研究进展,并对其发展前景作了简要评述。     

真核普通转录因子

三类真核ＲＮＡ聚合酶分别选择性地转录细胞核基因,其转录特异并不决定于ＲＮＡ聚合酶本身,而是取决于被转录基的启动子元件及能识别并结合这些元件的普通转录因子,它们与ＲＮＡ聚合酶相互作用,在启动子区组装成转录起始复合物,从而起动转灵,已知的三类普遍转寻因子中,大多数为相应ＲＮＡ聚合酶所专用,只有少数因子中的个别亚基是三类酶所通用。本简述这三类普通转录因子的结构,性质及其在转录中的功能。     

SAR与植物转基因沉默的消除

随着转基因技术在各个应用领域的深入和发展,转基因沉默现象已引起越来越多的人关注。转基因沉默主要发生在转录或转录后水平,涉及核酸的三种相互作用,即：ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ。这是植物基因表达调控的具体表现之一,也是外源基因插入后生物体的一种自我保护。ＳＡＲ协同转基因进行转化,可以消弱宿主ＤＮＡ对外源基因的不利影响。实验证明,在稳定整合的转基因植物中,ＳＡＲ提高了整体表达水平,并降低了不同转化体之间的差异。这是消除植物转基因沉默的一条有效途径。     

RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构与功能

ＲＮＡ聚合酶Ⅲ (ｐｏｌⅢ )是真核生物催化合成ｔＲＮＡ和 5ＳｒＲＮＡ及一些核小ＲＮＡ和胞质ＲＮＡ必需的酶。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ能够识别ｔＲＮＡ基因中一些高度保守的特征性ＤＮＡ序列而启动下游ＤＮＡ的转录 ,这些序列称为ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子不仅广泛存在于真核细胞中ｔＲＮＡ、Ｕ6核小ＲＮＡ(ＳＮＲ6 )等的基因中 ,也是病毒催化合成一些小片段ＲＮＡ如腺病毒ＶＡＲＮＡ所必需的。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子因其能在体内外高效快速地转录某些小片段基因 ,已被人们广泛地应用于核酶和反义ＲＮＡ技术中 ,在众多的ＲＮＡ…     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。     

双链探针实时荧光PCR核酸检测新技术研究*

目的:采用一种“双链探针”实时荧光PCR技术,提高HBV核酸检测灵敏度,并在同一反应管中实现代谢酶CYP2C19^*2基因型检测。方法:采用双链探针与TaqMan探针同时检测不同浓度HBV血清样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和结果统计分析;采用双链探针检测代谢酶CYP2C19^*2不同基因型样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和基因型确定。结果:不同浓度HBV血清样本检测,双链探针荧光本底低,检测灵敏度更高,与TaqMan探针检测结果相比,两者核酸检测Ct值存在显著性差异(P<0.05);双链探针检测36份样本的代谢酶CYP2C19^*2基因型,检测结果与Sanger测序结果完全一致。结论:双链探针实时荧光PCR检测技术可完成目的基因的高灵敏核酸检测,也可实现基因型分析。     

生物素标记HBV RNA探针的制备及应用

本文首次采用ＳＰ６５特殊质粒与人类的乙型肝炎病毒ＤＮＡ重组,制备了Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＲＮＡ探针,能特异地与ＨＢＶ ＤＮＡ杂交,将该探针与缺口转移方法标记的Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针进行了比较,结果显示出Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＲＮＡ探针比Ｂｉｏ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针的敏感性提高１０倍,并分别应用两种探针同时检测７０例乙肝病人血清中ＨＢＶ ＤＮＡ,阳性率各为３１．４２％、２８．５７％（Ｐ＞０．２５）。对Ｂｉｏ－     

DNA探针—测抗微生物抗性的替代方法?

<正>引言 利用DNA探针做传染病的临床诊断在科学文献的许多报告中已有描述。DNA探针方法学的应用首先是为了获得特异性抗菌素抗性基因传播的资料以及作为研究其发展关系的工具,而不是检测抗微生物抗性。然而DNA探针主要优点之一是它能够用于检出微生物特异性基因而不需要先行分离与生长。由于这一技术能在病人原始标本中直接测定传     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

地高辛标记核酸探针斑点杂交法检测轮状病毒疫苗中残余MA－104细胞DNA含量的研究

本文报导用地高辛标记核酸探针和分子斑点杂交技术检测轮状病毒基因重配株Ｌ－３株活疫苗中残余ＭＡ－１０４细胞ＤＮＡ含量的方法。提取和纯化ＭＡ－１０４细胞ＤＮＡ,将其ＡｌｕＩ酶切片段用随机引物法引导ＤＮＡ标记为探针。待检样品抽提核酸后点膜进行斑点杂交。此法灵敏度高,可检出０．１４ｐｇ的ＤＮＡ,特异性强,与非同源性ＤＮＡ无杂交。用此法检测轮状病毒基因重配株Ｌ－３株制备的疫苗,ＭＡ－１０４细胞残余ＤＮＡ含量低于１４ｐｇ低于ＷＨＯ限量标准,结果表明此重配株用于研制疫苗是安全的。     

普通结瘤基因探针鉴定根瘤菌的研究

普通结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）是所有根瘤菌所特有的、最为保守的基因,用苜蓿根瘤菌结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）和豌豆根瘤菌的（ｎｏｄＣ）基因片段为探钉,与５２株包括常见土壤细菌、已知根瘤菌、根瘤未知分离物的总ＤＮＡ进行斑点杂交,探索用普通结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）或（ｎｏｄＣ）探针鉴定根瘤菌的可能性。结果,未找到合适实验条件,使来自这两个种的结瘤基因只能与根瘤菌菌株杂交,而不与土壤细菌的菌株杂交。但在高温条件下,两种探针都专一性的和种内菌株杂交。此结果表明：在一定的实验条件下,普通结瘤基因探针用做根瘤菌的鉴定,只能     

银松素合酶基因地高辛标记RNA探针的合成

目的:体外转录合成银松素合酶(PS)基因地高辛标记反义RNA探针。方法:通过双酶切把PScDNA全长序列接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;同时,经由NCBI比对确定PScDNA的特异序列,设计含有SalⅠ和XbaⅠ这2个酶切位点的上、下游引物,用PCR法扩增含有该位点的目的片段,并连接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;最后利用pBlueskriptⅡKS( )上的启动子T7,用T7RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记PS全长及特异序列的反义RNA探针。结果:通过对构建探针的单、双酶切,PCR及电泳鉴定,表明成功合成了PS基因地高辛标记的全长及特异序列的反义RNA探针。结论:RNA探针的合成为后续马尾松PS基因表达的RNA原位杂交研究打下了基础。     

应用生物素标记DNA探针检测伪狂犬病病毒的研究

应用生物素标记ＤＮＡ探针检测伪狂犬病病毒的研究王琴,郭万柱,阴文奇（四川农业大学动物科技学院,四川雅安,６２５５０１４）关键词伪狂犬病毒,核酸,杂交,检测核酸杂交技术已广泛用于检测畜禽疱疹病毒和其它动物病毒,已报道ＰＲＶ－ＤＮＡ的探针方法有ＲＮＡ－Ｄ...