肠道菌共同抗原ECA(续二)

<正> 六、免疫原性 免疫原性菌株 抗ECA最初是在几个大肠艾希氏菌血清型(O14,O56,O124,O114)免疫的家兔血清中发现的,而许多大肠艾希氏菌的其它血清型免疫家兔明显地不能使家兔产生抗ECA。当用完整的死菌作免疫原时,很少几株菌(虽然以不同的血清学试验ECA为阳性)能导致抗ECA抗体的产生(表4)。虽然后来发现也能从无免疫原性菌种,如以在85％乙醇中溶解的组分制备免疫原性ECA,免疫原性菌种仍有区别:它们的有免疫原性的ECA部分是乙醇不溶解的,并存在于和     

肠道菌共同抗原ECA(续一)

<正> 五、ECA的遗传学测定 阻遏ECA的一种成份的生物合成的突变,可能会阻遏ECA的合成,结果在菌种中丧失ECA。相反,测定已知突变种的ECA含量可以帮助推断ECA的组成。不幸的是,没有已知的选择ECA阴性突变种的方法,所有我们现在知道的这样的突变种不是间接地选到就是偶然地发现的。 在UDP-葡萄糖,UDP-半乳糖,和GDP-甘露糖(pmi)生物合成中有缺陷的突变种干扰LPS的合成,此点在沙门氏菌和大肠艾希氏菌中易于利用。用它们来研究ECA是否存在,结果这些菌株全都是ECA阳性,提     

肠道菌共同抗原ECA(续三)

<正> 七、菌细胞中的ECA 很少知道ECA在细菌中的位置。至少有一部份位于细胞的表面;其中有些很容易释入到周围的培养基内,如以萤光抗丙种球蛋白处理以后激发出的萤光所显示的那样,抗ECA抗体附着于未损伤的(完整的)细菌。“ECA”依赖性萤光比LPS-抗-LPS所引起的要弱,它可能提示ECA比LPS显露的少或者(很象是由于大量LPS在外膜上) ECA存在较少。但对ECA的特异性萤光反应没有最后建立。 Whang及Neter二氏曾在伤寒沙门氏菌的甘氨酸诱发的(原生质)球状体中寻找ECA,并用血凝,血凝抑制试验和免疫试验判定其某些活性。意外的是,他们发现ECA只在球状体悬液中,不在上清液或溶解的菌悬液中,这可能表示ECA的量的减少。此点可用以支持ECA的位置在外膜的看法,膜的一部份分解在球状体中,但证明是微弱的和偶然的。     

肠道菌共同抗原(ECA)(续四)

<正> 九、其它交叉反应及有关抗原 各种“共同”抗原 其它在不同细菌间的共同或“交叉反应”抗原曾有记述,有些与ECA可能相同,有些与之有明显的区别。 Brodhage氏记述过一种血清学上的交叉反应性,大概是由ECA引起的,他称之为共同或“C”抗原。肠道菌中的ECA系用细菌的尿素提取物做间接血凝测定。出现这些交叉反应的抗血清是一种抗宋内氏志贺氏菌血清,大概含有抗ECA。宋内氏志贺氏菌培养物常常含有一部分R变种,这些菌具有R1型LPS核心,与ECA的免疫原性形式相连。 所有革兰氏阴性菌的外膜具有一种相似的成分:LPS,(脂)蛋白,和脂类。LPS代表O抗原的差别,它是形成大肠艾希氏菌及     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

炭疽杆菌保护性抗原(PA)重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性.从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA.PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA.vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western- blot检测表明PA在293细胞中得到表达.重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为12800.该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础.     

板状电泳在苏芸金芽孢杆菌亚种鉴定上的应用

作者用聚丙烯酰胺凝胶板状电泳技术,对1986年以前发表的苏芸金杆菌22个血清型29个亚种进行了酯酶分析,获得了较圆盘电泳更为准确、迅速、易区分的酮酶分析结果。其中H_1—H_(14)的20个亚种与圆盘电泳的结果相同。本文报道了1978—1986年间所发表的苏芸金杆菌9个亚种板状电泳的酮酶分析和生化测定的结果。从而确立了以酮酶型为主结合生化特性对苏芸金杆菌未知菌株进行鉴定的可行方法。     

前列腺干细胞抗原(PSCA)的表达及其特异结合肽的筛选

通过反转录 PCR从人前列腺癌细胞中克隆了前列腺干细胞抗原 (PSCA)基因 ,在大肠杆菌中利用pQE30载体对截断型PSCA基因进行了可溶性表达。蛋白纯化后 ,利用噬菌体随机展示 12肽库筛选了PSCA蛋白的特异结合肽 ,通过与EGFP蛋白的耦联表达验证了结合肽的特异性。此特异结合肽的获得 ,为进一步研究针对PSCA的前列腺癌靶向免疫治疗奠定了基础     

大熊猫肠道芽孢杆菌的分离鉴定及部分生物学特性

【目的】分析大熊猫肠道中芽孢杆菌的种类、纤维素分解能力、抗微生物作用和常用抗生素药物敏感性。【方法】利用芽孢耐高温特性分离菌株,基于16S r RNA基因序列构建系统发育树,通过测量芽孢杆菌在刚果红纤维素培养基上的分解圈分析其纤维素分解能力,采用牛津杯法测定芽孢杆菌的抑菌能力,结合软件分析抑菌能力和进化树之间的关系,通过PCR调查芽孢杆菌的抗菌肽分布规律,最后通过药敏试验检测芽孢杆菌是否对常用抗生素敏感。【结果】共分离得到21株芽孢杆菌;进化树显示,这些芽孢杆菌分为6个类别(Category);羧甲基纤维素钠水解结果显示,所有菌株均能分解纤维素;大部分芽孢杆菌菌株对3种肠道病原菌有较强的抑制能力,聚类分析表明,菌株的抗菌能力与基于16S r RNA基因的分类有一定的关联性;66.67%(14/21)的菌株中可以检测到2个或3个抗菌肽基因;药敏试验结果显示,菌株整体药物耐受率低,仅为7.54%(19/264),但仍有少数菌株对抗生素耐受。【结论】分离菌株种类丰富,分布平均,且均具有纤维素分解能力。21株菌株都含有抗菌肽基因,代谢产物对3种肠道病原菌具有明显抑制作用。常用抗生素耐受性低,对规范临床用药具有指导性。     

银染法在猪脾可提取性核抗原的小核RNA分析中的应用

可提取性核抗原(extractable nuclear antigens,ENA)是哺乳动物细胞核的生理盐水抽提物,它包括Sm、RNP、La(SS-B)和Ro(SS-A)等四种主要抗原成分。它们是由核内核糖核酸和蛋白质组成的复合物(snRNPs),其核糖核酸组分属于核内小RNA类,称为snRNAs。近几年来,小核RNA的研究愈来愈受到广泛重视。但是,由于含量极少,给分析带来困难。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因表达系统的构建及其鉴定

目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因（BPP）并连接至质粒pBS—T以形成重组质粒pBS—BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列（ara）并连接至质粒pBAD—A以形成重组质粒pBAD—ara,然后将增强绿色荧光蛋白（eGFP）基因连接至质粒pBAD—ara以形成重组质粒pBAD—ara—GFP。采用基因重组技术重组含有ara、BPP、eGFP基因序列并可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pBS—BPP—ara—GFP,激光共聚焦显微镜下观察含有pBS—BPP—ara—GFP质粒及对照质粒的E．coli,验证eGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以在E．coli中表达eGFP基因。结论通过基因重组方法成功构建了双歧杆菌表达系统,其可将外源基因分泌表达于菌体外。     

滇池金线鲃肠道产细菌素细菌的筛选鉴定及细菌素LSP01的抑菌作用

【背景】细菌素是微生物在生长过程中产生的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽类物质,可有效抑制或杀灭多种病原微生物。滇池金线鲃(Sinocyclocheilusgrahami)是云南滇池特有鱼种,长期生存在滇池恶劣的生态环境中,其肠道内可能存在着大量产细菌素的微生物资源。【目的】从滇池金线鲃肠道内筛选产细菌素菌株,并对其所产细菌素的抑菌特性及机制进行探究。【方法】对滇池金线鲃肠道细菌进行分离鉴定,利用牛津杯双层平板法筛选具有抑菌活性的产细菌素菌株,测定抑菌活性最佳菌株的细菌素酶敏感性、酸碱与高温耐受性、最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)与抑菌广谱性等抑菌特性,并借助细胞膜通透性、 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfonyl)-2h-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT)实验及扫描电子显微镜(scanning electronmicroscope,SEM)观察等实验探究细菌素的抑菌机制。【结果】从滇池金线鲃肠道中共筛选得到5株产细菌素细菌,隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)和乳杆...     

卵巢癌细胞系RMG-Ⅰ Lewis(y)抗原含量变化对其卡铂耐药性的影响

利用Lewis（y）抗原稳定高表达细胞株RMG-I-H,研究细胞表面Lewis（y）抗原含量变化与细胞对卡铂耐药性的关系．利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定不同浓度卡铂作用后细胞系RMG-I—H及其对照组RMG-I、RMG-I—C的细胞生长抑制率（IR）;利用流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡,同时检测药物作用后细胞的凋亡比率;利用荧光染色法和透射电镜进一步观察细胞凋亡状态．结果表明,RMG-I-H的半数抑制浓度（IC50）为（58．07&#177;2．42）,明显高于对照组RMG—I（28．83&#177;3．57）和RMG-I-C（25．71&#177;8．24）的IC50（P〈0．01）,后两者间无统计学差异（P〉0．05）,流式细胞仪分析证实3组细胞均存在凋亡,经30mg／L、60mg／L卡铂处理后细胞再进行流式细胞仪检测,RMG—I-H的相对凋亡率分别为（20．43&#177;0．71m和（38．11&#177;0．33）％,为对照组的49％-63％,明显低于对照组（P〈0．05）,2个对照组间比较无统计学差异（P〉0．05）,荧光染色和透射电镜直接观察了细胞形态变化,每个浓度组RMG-I-H的凋亡程度均低于RMG-I和RMG-I-C．说明细胞表面Lewis（y）抗原含量增加的同时,卵巢癌细胞对卡铂的耐药性增强．     

肿瘤特异性抗原(MAGE)在肿瘤免疫治疗中的作用

目前,已经发现肿瘤特异性抗原Mage基因家族有55个成员,其中MageA、B和C三个亚家族在各种组织来源的恶性肿瘤中特异性表达,正常组织(睾丸除外)均不表达。所以,Mage抗原作为肿瘤的特异性标志,在肿瘤的检测和免疫治疗方面具有很大的应用潜力。本文介绍了Mage家族的基因定位,Mage蛋白的特性,Mage基因的作用。同时,总结了近年来Mage基因家族在临床方面的应用研究结果。     

脆弱拟杆菌在炎症性肠病、结直肠癌促进、调控及防治中的作用

近年来人们越来越重视肠道菌群在肠源性疾病的发生、发展及防治中所发挥的作用。脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,BF)是定殖于人体肠道中的共生菌,对肠道健康有多种影响,是健康人群及腹泻、腹膜炎、腹内脓肿、败血症、炎症性肠病等临床病例最常见的肠道微生物。随着人们对脆弱拟杆菌的深入研究,发现脆弱拟杆菌与炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)、结直肠癌(colorectal cancer,CRC)有密切关系。通过对脆弱拟杆菌与IBD、CRC之间的关系进行综述,探究脆弱拟杆菌在IBD、CRC促进、调控及防治中的作用,为IBD、CRC的早期干预和治疗提供新思路,为开发基于脆弱拟杆菌的药物提供数据与思路。     

肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定

目的寻找肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）血清学检测用特异性抗原。方法双向电泳分离K.pneumoniae总蛋白,通过免疫印迹（Western blotting）与常见病原菌的多抗反应筛选特异性抗原蛋白,原核表达该蛋白并用ELISA法验证。结果获得K.pneumoniae的双向电泳图谱。寻找Western blotting中与K.pneumoniae自身多抗反应而不与与其它病原菌多抗反应的蛋白,质谱鉴定为酸性磷酸酶（Acid phosphatase,GI：238894261）。经表达纯化并以酶联免疫吸附试验（ELISA）验证,证明该蛋白作为包被抗原的灵敏度高,特异性强。结论 K.pneumoniae酸性磷酸酶是适用于该菌感染检测特异性抗原蛋白。     

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET42b(+)中,经IPTG诱导后,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的32.8%。     

香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌在无菌猪肠道中的定殖

【背景】已有研究表明,微生物在宿主肠道中的定殖受宿主、肠道环境、微生物物种特性和菌株来源等多个因素的影响。一般认为,来源于同类宿主的微生物菌株,在该类宿主肠道中具有定殖优势,但缺乏在物种和菌株水平上研究微生物自身特性在宿主肠道中定殖的研究报道。【目的】将不同来源(同类宿主肠道、非同类宿主肠道和非肠道环境)、具有不同生物学特性的3株香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)和4株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)对无菌猪肠道进行定殖,在物种和菌株2个水平上探究物种特性和菌株来源对宿主肠道定殖的偏好性,揭示影响微生物定殖效率的关键因素。【方法】在本项研究中,将从藏猪(Tibetan pigs)、小鼠(ob/ob mice)、食蟹猴(Macaca fascicularis)和发酵食品中分离得到的多株香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌,制成混合菌剂对无菌巴马香猪(Bama miniature pig)进行为期4周的饲喂,并通过实时荧光定量PCR方法检测这7株菌在无菌猪肠道中的定殖情况。【结果】在物种水平上,香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌在无菌猪体内具有相近的定殖...