腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

播散性马尔尼菲篮状菌病1例

患者,男,32岁,反复淋巴结肿大、发热伴皮疹2年,广谱抗生素、抗结核治疗无效,肺部CT提示两肺内多发结节,血γ干扰素抗体阳性,皮肤活检组织、淋巴结组织、肺穿刺活检组织均培养出马尔尼菲篮状菌,予两性霉素B脂质体联合伏立康唑治疗效果佳。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。     

艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病的研究进展

马尔尼菲篮状菌病是一种由马尔尼菲篮状菌引起的深部真菌病,易发于免疫功能缺陷和免疫功能障碍的人群。随着艾滋病患者的逐渐增多,马尔尼菲篮状菌的感染率也随之上升。该文从马尔尼菲篮状菌病的流行病学、临床表现、临床诊断和治疗综述了马尔尼菲篮状菌病的研究进展。     

不同交配型马尔尼菲篮状菌的抗真菌药物敏感性

马尔尼菲篮状菌是马尔尼菲篮状菌病的致病菌,具有不同交配型,且交配型分布具有地域差异.交配型是影响某些真菌药物敏感性的因素之一,但是否影响马尔尼菲篮状菌的药物敏感性不详.为了解马尔尼菲篮状菌交配型和其药物敏感性的关系,本研究检测了不同交配型马尔尼菲篮状菌对7种抗真菌药物的敏感性.结果显示,与MAT-1型马尔尼菲篮状菌相比...     

基于不同PCR方法的Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术研究

异育银鲫"鳃出血病"是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失。为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了Cy HV-2解旋酶基因和三联体蛋白基因的基础上,建立了检测CyHV-2的普通PCR、双重PCR、巢式PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR等方法,并对这5种PCR技术检测Cy HV-2的灵敏性进行了系统研究。结果表明,针对CyHV-2病毒的解旋酶基因和三联体蛋白基因,普通PCR能够检测出的极限值是2.4×10~4 copies/μL,双重PCR是1.4×10~4 copies/μL,巢式PCR是2.4×10~(-2)copies/μL,荧光定量PCR是2.4×10~(-2)copies/μL,环介导等温扩增是3.5×10~2 copies/μL。通过采用以上方法对从不同地区采集的54尾异育银鲫提取的DNA为模板进行临床检验,测定不同检测方法的阳性检出率。结果表明,实时荧光定量PCR和巢式PCR的检出率很高,分别为89%和90.7%;普通PCR的检出率最低,为68.5%。综合检测灵敏度和阳性检出率,环介导等温扩增(LAMP)是一种适用于生产实践的能有效检测CyHV-2的良好技术。     

HBV感染者外周血PBMC中TLR4 mRNA与病毒载量的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒感染者外周血PBMC中TLR mRNA与乙肝病毒复制的相关性。方法采用逆转录PCR检测外周血单个核细胞（PBMC）中TLR4 mRNA的含量,实时荧光定量Real Time PCR的方法检测HBV DNA,进行相关性分析。结果不同病毒载量组（〈1×103copies/μg DNA,1×103copies/μg DNA〈且〈1×105copies/μg DNA,〉1×105copies/μg DNA）TLR4 mRNA水平差异具有显著性（P〈0.01）,HBV病毒载量的对数值与TLR4 mRNA的含量存在负相关（r=-0.537,P〈0.01）。TLR4 mRNA的相对表达量与患者的ALT、AST呈正相关（r=0.608、r=0.659,P〈0.01）。结论HBV在患者体内复制活跃、病毒载量增高与外周血单个核细胞TLR4mRNA的表达下调有关。     

实时荧光定量PCR检测肺泡灌洗液在HIV阴性马尔尼菲篮状菌病诊断中的价值

目的 探讨实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测HIV阴性支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)对马尔尼菲篮状菌病诊断价值。方法 收集2019年9月—2022年6月就诊于广西医科大学第一附属医院的17例HIV阴性有肺部感染症状的TSM患者及33例肺部其他真菌感染患者或非感染患者的BALF及血清标本,分别提取总DNA,运用qPCR技术检测标本中TM菌载量值,并同时进行BALF真菌培养。结果 同一时间采集的17例外周血和支气管肺泡灌洗液中,在外周血样本中qPCR检测阳性仅11.8%(2/17),BALF真菌培养TM阳性患者同份BALF标本qPCR阳性率可达90.0%(9/10);BALF真菌培养TM阴性患者中,其同份标本有2例qPCR检测呈阳性。33例对照组患者的血清及BALF qPCR均为阴性。其中,BALF qPCR阳性样本的Cq值中位数为31.40,范围为20.71～35.59。同份BALF样本中,BALF qPCR技术(Kappa值：0.708)比BALF培养(Kappa值：0....     

马尔尼菲篮状菌感染动物模型的研究进展

马尔尼菲篮状菌Talaromyces marneffei是一种温度双相性致病真菌,原名马尔尼菲青霉Penicillium marneffei。马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌感染引起的一种严重的深部真菌病,主要流行于东南亚地区,在我国主要以南方地区多见,该病与HIV/AIDS的流行有高度相关性。近年来,随着艾滋病发病率的上升,马尔尼菲篮状菌病的发病率呈逐年上升趋势。该病发病隐匿,病死率高,但致病机制尚不明确。动物模型能够为疾病的发病机理和临床治疗等研究提供充分有力的证据,本文综述了马尔尼菲篮状菌感染动物模型的研究进展,对几种新型的动物模型进行了探讨。     

一种检测马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR方法的建立和应用

目的:建立一种检测马尔尼菲青霉菌的实时荧光定量PCR的方法。方法:针对马尔尼菲青霉菌5.8S rRNA设计特异性PCR引物,采用核酸荧光染料SYBR GreenⅠ进行实时荧光定量PCR检测,探讨该方法的灵敏度和特异性,并进行临床样品检测验证。结果:该方法的特异性较好,与该菌属内的其他细菌间无交叉反应;灵敏度可检测出10个细胞/mL全血,在检测范围内线性良好,相关系数R2=0.981。临床样品检测和传统的培养方法结果完全相符。结论:该方法特异性好,灵敏度高,操作简单,检测时间短;临床样品检测具有很好的准确性,从本研究的结果显示实时荧光定量PCR方法在检测马尔尼菲青霉菌中的应用可以大大缩短临床的诊断时间,提高临床诊断的准确度和效率。     

棉花黄萎病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用棉花黄萎病菌ITS区特异性引物建立了棉花黄萎病菌的实时荧光定量PCR检测方法。利用实时荧光PCR体系,以324 bp的PCR扩增产物构建了标准曲线并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果表明:该方法特异性良好,检测灵敏度为100 copies·μL-1,标准曲线的相关系数为0.994,扩增效率为91.5%。利用建立的检测方法对转基因棉田及常规棉田土壤样本进行检测,结果表明转基因棉田中棉花黄萎病菌数量显著高于常规棉田,与实际观测到的现象一致,也证明了本方法的可行性。因此,本研究建立的棉花黄萎病菌检测方法具有灵敏度高、重复性好等特点,为棉花的种植及病害防治提供了有效的检测手段。     

油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR检测技术的 建立与应用

【目的】建立快速检测甲烷氧化菌含量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术,用于油气微生物勘探。【方法】以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA片段的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立标准曲线,进行敏感性、重复性和特异性评价,并将该技术用于实际样品的检测。【结果】该技术标准曲线的相关系数R2为0.999 9,扩增效率为99.976%,检测范围为3.897×101-3.897×109 copies/μL,检出限约为40 copies/μL,重复性实验中CT值的变异系数优于3%,对12种非甲烷氧化菌均没有扩增,显示该技术具有很好的敏感性、重复性和特异性。利用该技术对气田、油田和非油气田土样进行了检测,发现气田具有明显的异常高值。【结论】为油气田的勘探建立了一种高效、特异、灵敏、准确的甲烷氧化菌荧光定量PCR检测技术,同时为其它指示菌检测技术的建立提供了参考。     

MADLI-TOF MS自建库在马尔尼菲篮状菌快速鉴定中的应用

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MADLI-TOF MS)自建库对临床分离马尔尼菲篮状菌快速鉴定的能力。方法收集广州、玉林、防城港3个地区临床分离的马尔尼菲篮状菌,通过ITS区扩增测序进行菌种准确鉴定。菌株通过微型玻璃珠研磨结合甲酸/乙腈提取法预处理。通过采集建库菌株不同时间点、不同平板上菌丝相和酵母相菌落的质谱数据,建立包含马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;并用非建库的马尔尼菲篮状菌及临床常见的真菌评估建立的自建库。结果建立了包含具有39个特征峰的马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;用于评估的菌株均被鉴定到种,准确率为100%。结论 MADLI-TOF MS建立的马尔尼菲篮状菌自建库能够对于临床马尔尼菲篮状菌进行快速、准确的鉴定。     

31例艾滋病合并马尔尼菲篮状菌肺炎的临床特征

正马尔尼菲篮状菌病(PSM),是东南亚国家及我国南方地区艾滋病常见的机会性感染之一,但是,本病缺乏特征性临床表现、易与AIDS合并其他肺炎相混淆,诊断有一定难度。笔者对我院31例艾滋病合并马尔尼菲篮状菌肺炎患者的资料进行分析,现汇报如下。1资料与方法一般资料收集2012年1月至2017年12月在我院住院的31例确诊为艾滋病合并马尔尼菲篮状菌肺炎患者资料,除外合并其他细菌感染患者和分枝杆菌感染患者。其中,男性25例,女性6例,年龄24～71岁,平均43±10岁。     

不同方法检测鸡胴体中沙门菌结果的比较研究

对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。     

马尔尼菲篮状菌基因研究进展

温度依赖性双相真菌马尔尼菲篮状菌可致局限性或全身播散性感染,在东南亚以及我国南方,尤其是广西、广东有区域性流行。该菌主要感染免疫力低下的人群,是流行区艾滋病患者特征性的机会性感染。文中主要介绍马尔尼菲篮状菌的相关基础知识、基因研究历史进程以及综述马尔尼菲篮状菌在生长发育、双相转换、信号通路、细胞壁合成、细胞代谢、应激反应、热休克、色素、毒力及耐药方面的基因研究进展。     

马铃薯立枯丝核菌拮抗菌QHZ11的实时荧光定量PCR快速检测与应用

【背景】植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)在根际的定殖是其发挥作用的基础,直观有效的跟踪技术和定量方法是研究PGPR在根际原位分布规律的重要工具。【目的】建立一种马铃薯黑痣病病原菌——立枯丝核菌拮抗菌QHZ11的实时荧光定量PCR快速检测体系,并检测拮抗菌QHZ11在马铃薯根际的动态变化。【方法】根据GenBank中登录的类芽孢杆菌及近源菌株gyrB基因序列差异筛选特异性引物,优化反应条件;通过盆栽试验对马铃薯根际拮抗菌进行快速检测。盆栽试验设3个处理,T1:对照(无菌水,CK);T2:QHZ11菌悬液灌土(QHZ11);T3:将功能菌在有机肥中进行二次固体发酵制成生物有机肥(BOF11)。【结果】筛选出拮抗菌QHZ11的专用引物为gyrB-F/gyrB-R;建立的拮抗菌QHZ11实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高且重复性较好,线性相关系数为0.999 8,检测组内变异系数均在1%以内,扩增效率为0.9,可检测出1×103-1×1010copies/g-soil的拮抗菌,具有检出限低和扩增效率高的特点。盆栽试验...     

卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立基于SYBR GreenⅠ染料法的卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法。[方法]选取卡他莫拉菌两个的基因(uspA1和copB)设计特异性引物;提取卡他莫拉菌、嗜肺军团菌等11种呼吸道病原体的DNA,通过常规PCR和实时荧光PCR对引物的特异性进行验证;以卡他莫拉菌DNA为模板进行实时荧光PCR,获取扩增曲线、标准曲线、熔解曲线和熔解峰图,并判断检测方法的灵敏度;进行重复性试验,评估检测方法的组内和组间重复性;通过模拟临床样本,对检测方法的灵敏度进行验证。[结果]共设计出3对引物,对嗜肺军团菌等10种呼吸道病原体具有特异性;对卡他莫拉菌的最低检出浓度为1.0×10^(3)cfu/mL;组内和组间最大变异系数分别为1.78%、1.89%;模拟的临床试验结果与预期相符。[结论]成功建立了卡他莫拉菌的实时荧光PCR检测方法,与10种常见的呼吸道病原体无交叉反应,且重复性变异系数小于2%,模拟临床试验灵敏度结果达到1.0×10^(3)cfu/mL。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。