长引物P CR法构建白念珠菌SCH9-MYC融合菌

目的：构建白念珠菌SCH9?MYC融合菌。方法运用长引物PCR扩增含有MYC标签和ARG4筛选标记的质粒序列,采用醋酸锂转染法将质粒序列同源重组到白念珠菌SN152的SCH9基因开放阅读框的C末端,在SC?Leu?选择性培养基上筛选阳性克隆,抽取阳性克隆基因组进行PCR验证,将验证为阳性的转染子进行生长曲线测定、spot assay、菌丝诱导实验,进一步筛选出表型正常的融合菌。结果通过PCR验证鉴定出3株融合菌构建正确,通过生长曲线测定、spot assay、菌丝诱导实验筛选出两株表型正常的融合菌菌株。结论运用长引物PCR扩增方法同源重组可以正确构建白念珠菌SCH9?MYC融合菌菌株。     

电转化法构建变形链球菌UA159 comD缺陷菌株

目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因缺陷菌株,为进一步研究该基因功能做准备。方法根据同源重组原理,利用变形链球菌UAl59comD基因同源重组DNA片段,采用电击转化方法获取转化菌落,通过形态学观察、生化特性检测、PCR及测序、RT-PCR对缺陷菌进行鉴定。结果在含有红霉素（10μg/mL）的琼脂平板上出现转化菌落,鉴定结果均显示转化菌为comD缺陷菌。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因缺陷菌株。     

白念珠菌SIM1基因敲除与功能研究

目的构建白念珠菌SIM1基因缺失菌,初步考察SIM1基因的功能。方法采用同源重组的方法构建SIM1基因双臂缺失菌,通过测定生长曲线、菌丝诱导、黏附上皮细胞等实验考察SIM1基因缺失菌表型。结果成功构建SIM1基因缺失菌,SIM1基因缺失后没有显著影响白念珠菌生长繁殖、菌丝及被膜形成,但白念珠菌对Caco-2细胞和KB细胞的黏附能力显著下降,对部分药物的敏感性增加。结论白念珠菌SIM1基因缺失导致细胞壁成分改变,并影响白念珠菌对宿主的黏附。     

大片段两步同源重组敲除节杆菌肌酐酸脱氢酶基因质粒的构建

构建一种新型的含有大片段同源臂的重组质粒用来对节杆菌进行代谢工程的改造。使用PCR扩增线性化载体片段,并通过酶切获取同源重组大片段,利用一步克隆技术将上述两片段连接起来;通过PCR-targeting将目标基因替换,并利用酶切自连将插入的片段删除,最后成功得到目标质粒p UK-d IMP。构建的质粒通过2次同源重组将目的基因肌酐酸脱氢酶(IMPDH)成功敲除,且最后菌株不含有任何抗性,开辟了一种针对节杆菌而言新型的基因改造方法。其中IMPDH基因缺失的菌株积累目标产物环磷酸腺苷的能力比对照菌株高49.7%,达到了(9.01±0.20)g/L。     

长臂同源多聚酶链反应法构建变形链球菌comD基因同源重组DNA片段

目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因同源重组DNA片段,为利用同源重组原理构建基因功能丧失菌株做准备。方法通过NCBI基因数据库获取变形链球菌的DNA序列,利用聚合酶链反应技术分别扩增变形链球菌UA159comD基因上、下游片段及抗红霉素基因片段,再通过长臂同源多聚酶链反应将这3个片段连接起来,形成同源重组DNA片段。结果经过PCR反应和琼脂电泳分析,得到了一个碱基数为3个单片段总和的连接片段,测序结果显示连接片段为预期的comD同源重组片段。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因同源重组DNA片段,可直接用于细菌转化构建comD基因缺陷菌株。     

产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆得到其丙酮酸脱氢酶基因(pdc)同源下游p3片段,并连接到广谱宿主载体pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL中构建了重组质粒pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL-p3,将此重组质粒转化到受体菌Z.mobilis CP4中,分别以Ppdc和p3片段作为同源上游和下游片段,利用同源双交换重组技术将重组质粒中的ldhL基因置换了Z.mobilis染色体中的pdc基因,得到重组菌株Z.mobilis CP4(△pdc∷ldhL).测得重组菌株乳酸产量为10.8g/L,明显高于出发菌株,说明初步成功构建了产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株.     

融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究

目的:在毕赤酵母SMD1168中表达融合抗菌肽,并检测其体外抑菌活性。方法:本实验从实验室先前构建的重组质粒pVAX1-RHKJT中克隆出已构建好的融合抗菌肽RHKJT基因片段,将RHKJT基因片段插入至pGAPZaA真核表达质粒中,通过PCR和测序验证,构建pGAPZα-RHKJT重组真核表达质粒,将线性化的pGAPZα-RHKJT电转化至毕赤酵母SMD1168中获得重组酵母SMDp G-RHKJT,并通过PCR和RT-PCR验证,对重组毕赤酵母SMDpG-RHKJT进行发酵,并收集发酵上清液进行体外生物活性测定。结果:成功获得重组酵母SMDpG-RHKJT菌株,重组酵母发酵上清液对大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、沙门氏菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、肺炎链球菌标准菌均具有显著的抑菌活性。结论:重组酵母表达的融合抗菌肽具有较广的抗菌谱和较高的抑菌活性,具有良好的潜在应用前景。     

甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究

目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。     

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。     

亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响

【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。     

嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立

构建嗜线虫致病杆菌Xna基因的同源重组载体和建立该细菌的遗传转化体系.扩增嗜线虫致病杆菌XNA基因的左右同源片段及质粒PEASY-T1上的卡那抗性基因Km;利用重叠延伸引物PCR法将这3个片段连接起来,然后将其克隆至自杀性载体PJQ200.采用电激法将同源重组载体DNA转化到供体细菌,再利用二亲本结合转移方法将供体细菌中的载体转化到受体细菌CB6菌株.结果成功地扩增了Xna基因的左右同源臂及卡那抗性基因的全长融合片段、构建了Xna基因的同源重组载体,并建立了嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传转化体系.     

替代失活法构建变形链球菌LuxS基因缺陷株

目的 LuxS基因是变形链球菌生物膜早期形成过程中的关键基因,构建该基因的缺陷菌。方法采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）方法构建含红霉素耐药基因片段的LuxS基因上、下游同源序列的连接片段,转化到变形链球菌中,在红霉素的平板上筛选缺陷菌株,并采用PCR鉴定。结果对变形链球菌LuxS基因缺陷菌株进行PCR和DNA序列测定分析证实构建成功。结论成功构建出变形链球菌LuxS基因的缺陷菌株,为后期针对变形链球菌LuxS基因的相关研究奠定基础。     

罗伯茨绿僵菌中嘧啶前体合成酶基因MrThi12的功能研究

通过同源基因比对,在罗伯茨绿僵菌中找到了单拷贝的嘧啶前体合成酶基因MAA_02402,命名为MrThi12。该基因MrThi12全长1 234bp,cDNA序列全长1 029bp,编码342个氨基酸。构建同源重组载体,利用农杆菌介导的方法进行基因敲除。突变菌株在维生素B1缺乏的培养基上,生长很慢,菌丝形态异常,多分叉,完全不能产生气生菌丝和分生孢子。但是一旦有外源维生素B1时,生长状态能完全恢复,对家蚕的致死能力没有变化。     

一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于pyrE筛选标记,利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组,敲除目的基因。由于基于环状质粒和pyrE筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时,普遍存在回复到野生型菌株的可能,导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷,文章建立了基于线性DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和pyrE标记,从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间,发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法,文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因,阳性克隆率达65%。这种线性DNA片段重组法为嗜盐古菌的基因敲除提供了一种高效策略,便于嗜盐古菌的基因改造。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

细菌染色体第1类整合子捕获耐药性基因盒反应模型的构建

【背景】整合子在细菌耐药性的获得及传播中占据重要地位,对于整合反应检测方法的改良及反应机制的研究,可以加深我们对细菌耐药性产生和播散的理解,为遏制耐药菌株的产生和播散提供新的途径。【目的】在细菌染色体上构建第1类整合子反应模型,用于评价整合酶介导的基因盒位点特异性重组。【方法】 PCR分别扩增含氯霉素耐药基因cat的CM片段、含基因盒aadA5的LacA5片段、含整合子重组位点attI1及强可变区启动子的PcS片段和插入位点两侧的同源臂,重叠延伸聚合酶链反应连接上述5个片段制备整合子模型插入片段,通过同源重组将构建好的整合子模型片段插入大肠埃希菌JM109染色体中。转入高表达第1类整合酶的质粒pHSint,在链霉素平板上筛选发生整合的菌株,并经聚合酶链反应和测序验证。【结果】构建的整合子模型片段经测序与预期一致,整合子模型片段成功插入大肠埃希菌JM109染色体中。转入高表达整合酶的质粒pHSint后,在链霉素平板上成功筛选出基因盒aadA5发生整合的菌株,经聚合酶链反应扩增并测序与预期一致。【结论】在大肠埃希菌染色体上成功构建第1类整合酶介导基因盒位点特异性重组反应模型,为进一步揭示整合子捕获耐药性基因盒的反应机制奠定基础。     

新型Red重组质粒pRO38的构建及Red系统的定向进化

[目的]构建新型Red同源重组质粒,对red基因进行分子定向进化,获取高重组效率的red突变基因。[方法]采用PCR的方法扩增不同的功能片断,通过体外同源重组的方法构建Red同源重组质粒pRO38。采用双链重组的实验验证质粒的同源重组功能后,随机突变red基因,通过修复neo缺失突变的方法筛选具有高重组效率的red基因突变质粒库。[结果]构建了长为5 593 bp的pRO38质粒,pRO38质粒具备正常的重组功能,可以有效地将kan-sac B片段插入大肠杆菌染色体。对pRO38中的red基因进行随机突变后,获得了约60个成功修复了neo缺失突变的菌落,而原始的pRO38质粒则无菌落生长。[结论]构建了新型的Red同源重组质粒。通过定向进化的手段,成功获得了高重组效率的red突变基因库,为从根本上提高Red重组效率打下了基础。     

酿酒酵母BJ3505 NHX1基因突变株的构建及功能验证

构建酿酒酵母NHX1基因单缺失突变株,验证其在酿酒酵母BJ3505抵抗逆境及液胞融合中的功能。利用同源重组技术构建BJ3505 NHX1基因的插入失活突变株BJ3505Δnhx1,并构建互补菌株BJ3505Δnhx1-C,对酿酒酵母NHX1基因在逆境胁迫及液胞融合中的功能进行验证研究。结果表明:与互补菌株BJ3505Δnhx1-C和野生型相比,突变株BJ3505Δnhx1抗逆能力减弱,液胞融合受影响,导致多液胞存在。利用同源重组法成功的构建了NHX1基因缺失突变株;酿酒酵母NHX1作为重要的离子反向转运体,在酿酒酵母BJ3505抵抗外界胁迫环境和液胞融合过程中发挥着重要的作用。     

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。     

胸腺素α1的乙酰化修饰不依赖于乙酰转移酶RimL

目的：考察大肠杆菌乙酰转移酶RimL对胸腺素α1（Tα1）乙酰化修饰的影响。方法：构建含500bp同源臂的卡那抗性基因打靶片段,利用Red同源重组系统,使大肠杆菌B121（DE3）的rimL基因插入失活,随后导入质粒pCP20去除抗性基因,构建突变菌株rimL-BL21（DE3）;将重组质粒pET-Tα1-L12分别转入出发菌株和突变菌株中进行表达,经固定金属离子亲和层析和反向高效液相层析后,将所得纯品进行质谱分析,精确测定相对分子质量。结果：PCR鉴定结果证明成功敲除rimL基因;质谱结果表明,rimL基因敲除菌中所表达的Tα1-L12融合蛋白与出发菌株一样,均有部分乙酰化修饰。结论：Tα1的乙酰化修饰并不依赖于RimL。