利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因

以晚疫病病原菌混合小种接种处理48h的马铃薯水平抗性材料(R-gene-free)叶片为目的材料,以未处理材料作为对照,用抑制差减杂交技术构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的差减文库。应用反向Northern技术对840个克隆进行斑点杂交筛选,筛选出150个病原诱导后信号明显增强的克隆。26个片段测序结果表明：部分片段基因功能与抗病性明显相关。7个差异表达片段与GenBank EST数据库中已有晚疫病原诱导马铃薯叶片得到的EST有很高同源性(达95％～100％);部分片段核苷酸或氨基酸序列分别与番茄、烟草、拟南芥等的EST序列或氨基酸序列有较高同源性;另有4个基因片段在GenBank EST数据库中未找到明显的同源序列,可能为新发现的基因片段。     

褐飞虱唾液腺中水稻抗性适应基因的分离

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)是一种危害水稻的重要害虫, 在取食水稻时其唾液腺分泌的一些物质能激发水稻产生一系列生理生化反应。为了从褐飞虱唾液腺中得到编码这些分泌物的基因, 本研究运用抑制差减杂交法（suppressed subtractive hybridization, SSH）和镜像选择（mirror orientation selection, MOS）法, 分别以取食抗虫水稻B5和敏感水稻TN1的褐飞虱唾液腺cDNA为tester和driver, 构建了一个含有768个克隆子的抑制差减杂交文库。经筛选得到102个EST, 插入序列长250~1 000 bp, 代表35个单基因。其中28个表达上调, 7个表达下调。经GenBank里的blastx在线分析工具分析, 除了约1/3的转录序列没有相匹配的蛋白质外, 其他EST所代表的氨基酸序列与已知蛋白存在不同程度的相似度, 如海藻溏酶、 卵黄蛋白原、 Ca²⁺结合蛋白、 组织蛋白酶B （cathepsin B）、 黏液样蛋白（putative mucin-like protein）、 羧酸酯酶（carboxylesterase）和碳酸酐酶（cah-3 carbonic anhydrase）等, 且多数蛋白含有信号肽, 推测与分泌有关。本研究将为进一步研究刺吸式昆虫中的激发子蛋白奠定了一定的基础。     

利用抑制消减杂交分离受褐飞虱取食下调的水稻基因

为了分离受褐飞虱取食抑制的水稻基因,采用抑制消减杂交的方法,以正常生长的水稻幼苗为目标群体,以褐飞虱胁迫32 h的水稻幼苗作为对照群体,构建了含200个重组质粒的SSH cDNA文库.随机挑选50个重组质粒进行反向Northern差异筛选后,再经Northern杂交验证,得到2个受褐飞虱取食抑制的基因:一个是Lhca,编码水稻光系统Ⅰ天线蛋白;另一个基因(bpHd002)与肌苷-5'-单磷酸脱氢酶基因有同源性.以BpHd002为探针筛选水稻幼苗cDNA文库分离出该基因的全长cDNA(BpHd002A).其长度为1 285bp,含有一由519 bp组成的完整的阅读框,编码的蛋白质具有两个CBS结构域.     

水稻褐飞虱抗性基因研究进展

随着全球性气候变暖以及稻作区耕作栽培措施的改变,稻褐飞虱已成为严重危害水稻产量的害虫之一.综述当前水稻褐飞虱抗性基因的定位、克隆以及抗性机制的最新研究进展,并对抗褐飞虱水稻育种的利用现状作报道.     

水稻品种对褐飞虱持续抗性的筛选技术

通过水稻品种苗期和分蘖期后对褐飞虱的抗性筛选,提出TN_1受害9级时受害1～5级的为抗性品种,TN_19级后苗期10天、分蘖期后24天内保持1～5级的为持抗品种,不具持抗的抗性品种为短期抗性品种。     

水稻抗褐飞虱基因研究和利用现状

稻褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是一种单食性水稻害虫,根据其对水稻品种的危害,可分为生物型1、2、3、4等类型。它对亚洲各国水稻生产造成极大危害。实践证明,利用抗虫品种是防治稻褐飞虱最经济有效的方法。本文综述了稻褐飞虱的生物学特征和分布、生物类型,着重介绍抗稻褐飞虱基因的研究和利用现状,并对今后开展抗稻褐飞虱基因研究提出几点建议。     

受褐飞虱取食的水稻幼苗的抑制消减cDNA文库的构建及筛选

采用抑制消减杂交方法,以褐飞虱取食32h的水稻幼苗及未受褐飞虱取食的水稻幼苗为作为对比材料构建了消减cDNA文库,以分离水稻幼苗中褐飞虱应答基因。随机从消减cDNA文库中挑选16个白色菌落提取质粒,进行PCR扩增,发现插入片段的长度位于100～900bp之间。以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的基因(BpHi008A)为探针,通过斑点印迹分析发现在抑制消减后的cDNA池中,目的基因得到有效富集。利用反向总RNA斑点印迹分析和Northern杂交验证,从消减cDNA文库中筛选到了25个基因受褐飞虱取食的诱导。其中有17个克隆与编码已知功能蛋白的基因有显著的同源性,它们分别参与蛋白质的折叠与降解、蛋白质与蛋白质的相互作用及信号传递、脂类代谢、胁迫反应、物质运输和细胞生长等。总体上,参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后表达增强。     

水稻品种对褐飞虱持续抗生的筛选技术

通过水稻品种苗期和分蘖期后对褐飞虱的抗性筛选，提出ＴＮ１受害９级时受害１－５级的为抗生品种，ＴＮ１９级后苗期１０天、分蘖期后２４天内保持１－５级的为持抗品种，不具持抗的抗性品种为短期抗性品种。     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理（submergence-treated,ST)的玉米（Zea maysL.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理（untreated,UT)的玉米幼苗cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交。用经过UT差减的STcDNA构建了一个含有大约2000个独立克隆的差减文库。对随机挑取的408个克隆进行差异筛选。获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆。对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段。GenBank中BLAST查询结果表明;6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%-90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列。可能代表了新基因。或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性。     

水稻品种对褐飞虱的田间抗性及其生态学机制

评价了7个水稻品种(浙粳22、宜香845、中组14、秀水123、二优倍九、感虫对照品种TN1和抗虫对照品种IR36)在田间成株期对褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)的抗性表现,并初步分析了它们的抗性机制。结果表明,在田间网室人工诱发条件下,浙粳22、宜香845、秀水123和中组14等4个品种的抗性水平与抗虫品种IR36相同,均小于3级,表现为抗虫,而二优培九则与感虫品种TN1相同,表现为感虫。在自然发生条件下的水稻分蘖期至乳熟期,宜香845和中组14上褐飞虱数量仅为TN1上的7.84%～24.44%,秀水123和浙粳22则为TN1上的30.19%～60.27%。在4个抗性品种上褐飞虱的产卵量和卵孵化率明显减少,而若虫存活率仅为TN1上的20%～30%。与IR36相同,4个抗性品种上褐飞虱的若虫存活率和种群增长倍数均显著低于TN1上,说明他们对褐飞虱的抗性主要表现为抗生性。     

家蝇幼虫消减文库的构建及差异表达基因的鉴定

为了鉴定家蝇Musca domestica免疫相关基因,应用抑制性消减杂交技术,构建刺激家蝇幼虫差异表达cDNA消减文库。以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus诱导12 h的家蝇幼虫与未诱导的家蝇幼虫为消减杂交对象,获得了差异表达基因的cDNA片段,将其与T/A载体连接并转化大肠杆菌DH5α,构建了刺激家蝇幼虫cDNA消减文库。PCR检测发现,文库的阳性克隆中插入的cDNA片段大小在200~1 000 bp之间,随机挑选了161个含大小不等差异片段的克隆进行测序和同源性分析,鉴定了36种蛋白的基因片段,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白、其他功能蛋白以及功能不明的蛋白。用半定量RT-PCR分析了其中6种蛋白基因的表达,结果显示：防御素和攻击素基因在细菌刺激后24 h内明显上调表达,而溶菌酶、酚氧化酶原活化因子、糜蛋白酶和蛋白质合成起始因子基因在细菌刺激后0-4 h内表达受抑制,12 h后上调表达。该研究结果为家蝇免疫相关基因的克隆和家蝇免疫防御机制的探讨奠定了良好的基础。     

应用抑制消减杂交分离雌、雄鸡胚性分化早期的差异表达基因

分离不同性别的鸡胚性分化早期差异表达基因,可为禽类性别决定和性分化机制研究提供基本信息。本研究分别以孵化3.5-6d的雌、雄鸡胚性腺为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了雌-雄鸡胚间正、反向消减cDNA文库,并利用斑点印迹杂交从中筛选出了39个性别差异表达的阳性cDNA克隆。以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率,结果发现两个文库的消减效率均高达25倍。插入片段PCR鉴定结果显示,消减文库中cDNA插入片段的长度主要分布于250-750bp之间。分别对雌、雄鸡胚消减文库中的252和168个cDNA克隆进行斑点杂交筛选,再随机从两个消减文库中共抽取39个阳性差异表达克隆进行序列测定及序列比对分析。结果表明:这39个cDNA克隆分别代表了定位于鸡不同染色体上的18个已知功能的基因和11个假定基因;参照哺乳动物同源基因的功能,所得的18个已知差异基因可能参与多种生物反应过程。用半定量RT-PCR方法对雌、雄鸡胚消减文库中各5个基因的表达情况进行进一步验证,发现除雌性库中的一个基因外其它9个基因均有较明显的性别差异表达。这些性别差异表达基因的获得为进一步研究鸡胚性腺发育中的基因表达调控奠定了基础     

利用SSH方法筛选与鉴定AC3基因缺失小鼠主要嗅觉表皮内的差异表达基因

腺苷酸环化酶3(Adenylate cyclase 3, AC3)基因在小鼠主要嗅觉表皮(Main olfactory epithelium, MOE)内的嗅觉信号传导中起着重要作用, AC3缺失是否会导致MOE内与之相关的基因发生差异表达, 尚待确定。文章利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)方法, 以AC3敲除(AC3^-/-)及其同窝出生的野生型(AC3^+/+)小鼠MOE为材料, 构建了正向和反向两个消减文库, 采用斑点杂交对消减文库进行初步筛选, 对筛选出的差异表达基因进行序列测定及生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行验证。斑点杂交筛选获得了386个差异表达克隆, 随机选取其中的80个进行DNA序列测定, 经序列比对后发现有62个在GenBank上获得了与之相匹配的基因信息, 其中24个上调差异表达克隆对应于kcnk3、mapk7、megf11等基因, 38个下调差异表达克隆对应于tmem88b、c-mip、skp1a、mlycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法对这些差异表达基因进行蛋白功能注释, 发现它们主要集中在分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取其中上调基因kcnk3和下调基因c-mip、mlycd、tmem88b及trappc5进行qRT-PCR验证。结果表明, 在AC3^-/-小鼠MOE内kcnk3的表达量显著上调, 是对照组小鼠的1.27倍, 而c-mip、mlycd、tmem88b和trappc5的表达量显著下调, 为对照组小鼠的20%、7%、32%和29%。这些基因的功能与K⁺通道、细胞发育与分化、脂肪代谢和膜蛋白转运等密切相关。推测它们可能与AC3基因共同作用, 调节小鼠MOE内的嗅觉信号传导信息。     

褐飞虱2009年秋季回迁的雷达监测及轨迹分析

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)是水稻生产上重要的迁飞性害虫,研究其迁飞、扩散规律,为早期预警和有效防治提供科学依据。2009年4月27日至10月11日, 在中国农业科学院植物保护研究所重大病虫害监测预警兴安雷达站内利用毫米波扫描昆虫雷达对褐飞虱的迁飞过程进行长期观测,高空探照灯诱虫器及佳多自动虫情测报灯诱虫器分别用来诱捕高空及地面的褐飞虱,对高空探照灯诱到的褐飞虱雌成虫随机挑选30头进行卵巢解剖, 并结合大区环流和利用Hysplit_4模型进行轨迹分析,研究了褐飞虱的秋季回迁过程和虫源。结果表明：褐飞虱秋季回迁高峰期出现在9月28日至10月7日,高峰日为10月1日, 高峰日内雷达回波主要在600~1 100 m范围内聚集成层,高空探照灯诱虫器内褐飞虱的数量达到了13 620头;卵巢发育级别以1~2级为主。轨迹分析显示：本次回迁的褐飞虱主要来自湖南衡阳和永州等地,随东北气流向广西柳州、南宁和崇左等方向迁飞。轨迹推断与褐飞虱实发虫情基本吻合,通过毫米波扫描昆虫雷达确定了褐飞虱秋季回迁的高度,为毫米波扫描昆虫雷达早期投入到预测预报的实践中奠定了基础,对我国褐飞虱早期预警体系的建立将提供必要的技术支持。     

几种植物次生物质对褐稻虱种群的控制作用模拟

为探讨褐稻虱Nilaparvata lugens (Stål)种群生态控制的作用机理,应用状态空间方程和作用因子添加分析法,研究植物次生物质不同组合对褐稻虱种群的控制作用;本研究以薇甘菊Mikania micrantha乙醇提取物、 飞机草Eupatorium odoratum乙醇提取物与现代苦楝Melia azedarach油的不同组合,作用于褐稻虱种群;根据不同虫期的调查数据,拟合出控制矩阵中各分块矩阵的元素值,并对褐稻虱种群的控制作用进行模拟。结果表明：单独施用薇甘菊乙醇提取物（1 g DW/100 mL）、飞机草乙醇提取物（1 g DW/100 mL）、 现代苦楝油（200倍）各1次, 能显著降低褐稻虱种群数量, 然而种群趋势指数I（population trend index）仍在1.00以上,即下代褐稻虱种群仍呈增长趋势,联合添加其中2种或3种能持续控制褐稻虱下代种群的增长。同时,植物次生物质对褐稻虱种群的控制作用主要表现在对成虫产卵的忌避作用,尤其是在本田种群建立的初期,由于其显著的忌避作用, 降低田间卵量,使其种群数量明显降低,可有效地控制其为害。     

标化消减杂交:提高差异表达cDNA筛选效率的新策略

在回顾分析了消减杂交技术改进历程的基础上,我们提出了“标化消碱杂交策略”,此策略的核心是“用标化cDNA制备消碱杂交反应的单链驱动子和单链示踪子,分离回收消减杂交后的单链示踪子用于制备差异表达cDNA库,并从标化cDNA库制备探讨来对差异表达cDNA库进行检测”将主要用于筛选与细胞特殊表型密切相关的（或与不同发育阶段等密切相关的）呈“全或无”差异形式表达的低丰度全长cDNA。此策略有望能较以往的消减杂交策略在降低假阳性背景、提高低丰度差异表达cDNA获得率、得到较长甚至全长差异表达cDNA等方面有较好表现,但尚待检验。     

Application of suppression subtractive hybridization (SSH) to cloning differentially expressed cDNA inDunaliella salina (chlorophyta) under hyperosmotic shock

Two subtracted cDNA libraries ofDunaliella salina (Volvocales, Chlorophyceae) under different hyperosmotic shock were constructed using the suppression subtractive hybridization (SSH) method. The mRNA isolated from algae grown without stress was used as a “driver”, and the mRNAs isolated from algae 16 h (short-term treatment) or 7 d (long-term treatment) after salt stress were used as “testers”. The differentially expressed cDNA fragments inD. salina under salt stress were identified by screening these 2 libraries. Two cDNA fragments,D27 andD114, were identified from clones pL27 and pL114 after the long-term treatment. Three cDNA fragments,D21, D39, andD88, were identified from clones pSh21, pSh39, and pSh88 after the short-term treatment. The homology analysis revealed that D27 was highly similar (91%) to the subunit V of PS I reaction center inChlamydomonas reinhardtii. D21 was similar to fructose-1,6-diphosphate aldolase (78.4%). After searching GenBank with the sequences ofD39, D88, andD114, no similar sequences were found. Northern analysis revealed that the expression levels of all 5 cDNAs were increased significantly after salt stress. This means that SSH can be used in cloning differentially expressed cDNAs inD. salina under salt stress. The expression ofD27, D21, andD88 wasde novo induced by salt stress, and the expression ofD114 andD39 was increased from a relatively lower level; this indicates that all 5 cDNAs might exert an influence on the alga under hyperosmotic shock.