T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

苜蓿根瘤菌nodA蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

苜蓿根瘤菌nod A蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

基因工程

950714在Acetobacter methanoIicus B58中表达异源基因的广寄主范围质粒的构建[英]/FoelIner,C.G.…/Acta Biotechn01.1994,14(2).一141~151[译自DBA,1994,13(16),94—090093 在广寄主范围质粒RSFlolO复制子基础上构建了质粒,以此在嗜酸性甲基营养型A.raetkaaol-icus B58中有效表达异源基因。用启动子:探针载体质粒pRS201鉴别并分离出醋杆菌噬菌体AcmlDNA的含启动子序列。将此质粒与大肠杆菌启动子tac和pr相连,分别构成表达载体质粒pRS201tac和pRS201pr。将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因插入到克隆的启动子下游之后,测定了大肠杆…     

基因标记、转化、表达与检测

930450采用交叉调节系统使大肠杆菌表达I组蛋白[会,英]/Kalli0,P.…,Abstr.Pap.Am.Ch—em.Soc.一1992,203Meet,Pt.1.一BI OT‘84[译自DBA,1992,11(15),92—083573 这个新表达系统的产物礞白是氯霉素酰基转移酶。CAT基因和cI阻遏物基因的转录由tac启动子来调节,而lacI基因的转录则由九·噬菌体pL一启动子调控。加入诱导物IPTG可提高CAT蛋白和cI阻遏物的表达,从而抑制lac阻遏物的表达,进一步增强CAT的表达。叙述了在各种拷贝数的质粒中对新系统的构建,并将CAT表达的结果与通常使用的构成性调节系统散了比较。分批诱导的结果与…     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

盐生盐杆菌RM07 DNA片段在大肠杆菌中的定点诱变和启动子功能分析

将来源于嗜盐古生菌——盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)基因组的RM07 DNA片段以正反两个方向分别插入大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8携带的报告基因——氯霉素抗性基因(cat)的上游,得到RM07-cat融合的质粒pRM07-1( )和pRM07-1(-),将其分别转入大肠杆菌HB101,进而检测了不同转化子菌株的氯霉素抗性水平和细胞内氯霉素乙酰转移酶蛋白质浓度。结果表明：正向的RM07片段在真细菌(大肠杆菌)中具有启动子活性,能够驱动cat报告基因的表达;而反向的RM07片段在大肠杆菌中不具有启动子活性。对RM07片段进行了定点诱变分析,检测了特定核苷酸突变对启动子活性的影响,结果进一步精确定位了RM07片段中对在大肠杆菌中的启动子功能有重要作用的关键碱基,并且通过改造RM07片段的碱基组成成分大幅提高了其在大肠杆菌中的启动子活性。     

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B 基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。     

利用大肠杆菌质粒检测与分离痘苗病毒的启动子

本文发现,痘苗病毒DNA一些巳知的启动子序列和一些功能尚不清楚的DNA片段,可以在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltrsnsferase,简称CAT)基因的转录和表达,使转化细菌呈现氯霉素抗性表型,这一结果证明,痘苗病毒的启动子可以被大肠杆菌的RNA多聚酶所识别并有效工作。同时发现不同启动子具有不同的强度,利用大肠杆菌质粒分离和检测痘苗病毒的启动子序列,不仅可以研究痘苗病毒基因组的表达调节特点,而且也为组建痘苗病毒表达载体提供了一个快速、简便可靠的方法。     

原子力显微镜力谱研究大肠杆菌启动子与RNA聚合酶的相互作用

【目的】本研究通过原子力显微镜(AFM)力谱技术研究了大肠杆菌启动子与RNA聚合酶(RNAp)间的相互作用,目的是建立一种高效的体外表征启动子的新方法。【方法】优化了用于单分子AFM力谱分析的蛋白固定化策略,建立AFM力谱分析启动子的策略,以缺失识别启动子序列的σ亚基核心RNA聚合酶(RNAp-C)为对照,研究启动子/RNAp间相互作用的特异性。最后比较了序列较典型的Ls1启动子和缺失–10区的Ls2启动子的力谱。【结果】基于建立的方法,验证了Ls1与大肠杆菌RNAp结合的特异性,其相互作用力为(331.10±5.10)p N。与Ls1相比,Ls2启动子与RNAp结合显著减少。利用启动子探针质粒,以报告基因cat的表达产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的酶活验证Ls1、Ls2启动子强度,分别为(181.70±4.10)、(0.30±0.20)U/mg。【结论】本研究建立的基于AFM力谱技术的启动子分析技术,是一种高效的、直接定量表征启动子活性的新方法。     

中间载体pBz6102的构建及CAT基因在转化烟草中的表达

来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPT),氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)以及来源于昆虫的荧光素酶基因等都是用于研究根癌农杆菌转化植物的良好标记。我们利用氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和来源于Ti质粒T-区DNA的tmr基因,构建了中间载体pBZ 6102,并通过植物基因工程载体pGV 3850,将氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和tmr基因引入了植物细胞,并测到了表达,在抗氯霉素植物中测到了氯霉素乙酰转移酶活性。中间裁体pBZ 6102上还有Pst Ⅰ,Xba Ⅰ等单一的限制性内切酶位点,外源基因极易插入。转化植物F_1代的种子抗性分析表明,80%左右的种子都能在含氯霉素的培养基上正常萌发,它们的幼苗中都有氯霉素乙酰转移酶活性,证明CAT基因通过了减数分裂稳定地保留在植物细胞的基因组内。     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。     

利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。     

通过一种新方法使T7基因I置换araBAD基因簇

目的:用T7 RNA聚合酶基因T17基因I置换大肠杆菌基因组中的araBAD基因簇.方法:通过分析大肠杆菌基因组中araBAD基因序列,设计两侧同源臂,构建高拷贝数的打靶质粒,并且在这个质粒上的打靶片段两侧各加上一个归巢内切酶位点;将辅助质粒和打靶质粒同时转化到宿主体内,在L-阿拉伯糖的诱导下表达归巢内切酶和Red重组酶,实现体内重组,使T7基因I置换araBAD基因簇.结果:在4株不同的大肠杆菌中用T7基因I置换了araBAD基因簇.结论:成功地将T7基因,整合到araBAD基因位置,为构建Para-PT7表达系统奠定了基础.     

人U6基因POI Ⅲ启动子表达反义VEGF cDNA抑制SMMC-7721肝癌细胞VEGF表达的观察

 由 RNA聚合酶启动子在细胞内转录高浓度反义 RNA是抑制靶蛋白的一种有效手段 ,有报道 POI 启动子转录小分子 RNA存在效率不高 ,带有较多的非特异性序列等缺点 ,为了克服这些问题 ,表达反义 VEGF RNA的人 U6基因表达盒对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制作用进行了研究 .首先 PCR扩增 2 0 0 bp VEGF c DNA以正、反向插入人 U6 sn RNA.通过测序证实反向插入的正确性 .采用细胞原位杂交 ,RNA酶保护分析 ,Northern印迹来证实反义 RNA表达的情况 ,利用 RT- PCR方法研究了其对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制效果 .细胞原位杂交结果显示 U6启动子转录产物主要分布于细胞核内 ,细胞浆内亦有表达 ,RNA酶保护分析显示 U6基因 POI 启动子能高表达所需大小反义 RNA,Northern印迹结果显示脂质体 lipo-fectamine介导含 U6基因 POI 启动子的质粒转染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1后 1 2 h即有表达且可持续表达 6 d. RT- PCR证实 U6基因 POI 启动子转录的反义 VEGF RNA能有效抑制SMMC- 772 1细胞 VEGF的 m RNA表达 .已有的研究结果揭示 POI 启动子是反义基因治疗中一种好的选择     

人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调控区在大肠杆菌中也具有增强子样的效应

采用痘苗病毒7.5k、11k及N2启动子,以大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-lac)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)作为标记基因,构建了大肠杆菌增强子样序列的系列检测载体。采用上述检测载体发现人乳头瘤病毒6b(Human papillomavirus type 6b,HPV-6b)上游调控区(Upstream regulating region,URR)中540bp的Sau3A-Nar Ⅰ片段,在大肠杆菌中对痘苗病毒启动子控制的CAT基因的表达有明显的增强作用,可使基因表达提高4～5倍;对β-lac基因的表达可提高3～6倍。根据这一片段的插入方向增强基因表达水平有所不同。     

马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究

从马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区某一点,将介于MDVpp38基因和1 8kb转录子之间的双向启动子分割成两个单方向的启动子。以pp38为报告基因,pUC18质粒为载体,构建了含不同方向完整启动子序列的pProfpp38和pProrpp38质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfpp38和pdProrpp38质粒。4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞(Chickenembryofibroblast,CEF)后,均能检测到pp38基因的表达。进一步以氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyltransferase,CAT)为报告基因,构建了含不同方向完整双向启动子的pProfCAT和pProrCAT质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfCAT和pdProrCAT质粒。通过转染试验,定量分析了完整启动子和分割后启动子在两个方向上的启动活性。实验结果表明,分割后的启动子在两个方向上的启动活性均比相应方向上完整启动子的活性低,其中1 8kb转录子方向上的活性下降了4 1倍     

谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭型启动子探测载体构建

从质粒pXZ10145和pUC19出发,构建了一个谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pAK6。pAK6的大小为5684bp,带有卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择标记,以及多克隆位点。在pAK6基础上,构建了以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的启动子探测载体pAKC6,pAKC6的大小为6474bp。采用鸟枪法,将经Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌基因组片段连入pAKC6;根据谷氨酸棒杆菌对氯霉素的抗性,从中分离出两个具有启动子功能的插入片段。通过测定报告基因氯霉素乙酰转移酶的活性,对两个启动子片段在谷氨酸棒杆菌中的强度进行了初步的判断;测序后,用启动子预测软件对其结构进行了预测,证实了启动子序列的存在。     

噬菌体T7溶菌酶工程菌的构建

将噬菌体T7溶菌酶基因克隆到含有可诱导性启动子LacUV 5的表达载体pARl206中。在没有诱导剂存在情况下,LacUV 5启动子的转录受到抑制。当带有重组质粒的转化菌生长到适当浓度,向培养液中加入0．4mmo1／L IPTG,LacUV 5启动子受到诱导,从而使插入的基因高水平表达,并积累大量具有生物活性的溶菌酶。噬菌体T 7溶菌酶在大肠杆菌中表达的产量平均约22mg／L。