腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达

构建由肝癌细胞专一的ａｆｐ基因表达调节元件控制自杀基因ＨＳＶ－ｔｋ的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到ＡｄｒＡＦＰＴＫ病毒。经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等证实它们含ａｆｐ元件和ｔｋ基因。空斑形成试验表明病毒效价达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。同时构建由ＣＭＶ启动子控制ｔｋ基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染ＡＦＰ阳性（ＨｅｐＧ２）或阴性（ＨｅＬａ,ＢＲＬ－３Ａ）细胞株（ｍ．ｏ．ｉ．＝１００）,以丙氧鸟苷（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）处理后,用ＭＴＴ法测定杀伤细胞的效应。结果,ＡｄＣＭＶＴＫ感染这三种细胞后,ＧＣＶ半杀伤浓度分别为１．３、２、＜１μｍｏｌ／Ｌ;但是,ＡｄｒＡＦＰＴＫ感染的ＨｅＬａ和ＢＲＬ－３Ａ细胞的ＧＣＶ半杀伤浓度都＞１０００μｍｏｌ／Ｌ,而对ＨｅｐＧ２细胞只有＜１μｍｏｌ／Ｌ,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒ＡｄｒＡＦＰＴＫ可望用于肝癌的专一性基因治疗     

CEA启动子控制HSV-TK基因表达对人结直肠癌细胞的杀伤作用

构建了以CEA启动子控制的HSV-TK基因表达质粒pCEA-TK。转染pCEA-TK的人结肠癌细胞LoVo对GCV的敏感性提高了1300倍。同样条件下,人宫颈癌细胞HeLa对GCV的敏感性仅提高8倍,且对低于血药浓度(20μmol/L)的GCV不敏感。以上结果显示在GCV存在时,CEA启动子控制下HSV-TK基因的表达使CEA阳性的人结直肠癌细胞获得专一性杀伤。此外,DNA片段分析和电镜观察表明GCV诱导转染pCEA-TK的LoVo细胞发生凋亡可能是这个系统杀死肿瘤细胞的机制之一。本工作还讨论了癌胚抗原(CEA)基因启动子用于人结直肠癌专一性自杀基因治疗的可能性。     

甲壳胺诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的:通过体外实验探讨甲壳胺是否对人肝癌细胞HepG2具有生长抑制及诱导凋亡作用.方法:在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的甲壳胺,培养48 h,于倒置相差显微镜下观察甲壳胺处理组及对照组细胞形态学变化;用流武细胞术(FCM)检测HepG2细胞的凋亡率,Western印迹检测甲壳胺处理组及对照组Bcl-2和p53蛋白...     

紫花牡荆素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的：研究紫花牡荆素（Casticin）对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法：用终浓度为0、0.5、1.0、2.0umol/L的Casticin作用于HepG2细胞,于12、24、48h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342核染色,观察细胞形态学变化;24h后收集各组肝癌HepG2细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivin mRNA表达。结果：MTT法检测显示,Casticin对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;Hoechst33342染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,Casticin处理后凋亡细胞比例增加;Casticin作用24h后,细胞被阻滞于G2/M期,随药物质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加;RT-PCR结果显示,Casticin下调肝癌HepG2细胞survivin mRNA表达。结论：Casticin在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断Casticin诱发肝癌细胞凋亡与其对survivin基因表达的抑制有关。     

腺病毒载体介导CEA基因元件调控自杀基因治疗

构建以CEA启动子控制HSV-TK基因表达的复制缺陷型腺病毒载体(AdCEATK).纯化的重组腺病毒滴度达1×10¹²pfu/ml.CEA阴性的HeLa细胞感染AdCMVTK后对丙氧鸟苷(GCV)很敏感,而感染了AdCEATK后不被GCV杀伤.与此相反CEA阳性的LoVo细胞中AdCMVTK和AdCEATK都有很好的表达活性,说明CEA启动子有良好的细胞专一性.AdCEATK/GCV系统还有明显的旁杀伤效应.此载体将有助于实现对CEA阳性肿瘤的专一性自杀基因治疗.     

乙肝病毒X蛋白诱导肝癌细胞凋亡的信号转导途径

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)X蛋白(HBX)与肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生具有密切的关系.HBX不但具有拮抗细胞凋亡的作用,还具有促进细胞凋亡的作用.为了进一步探讨HBX促细胞凋亡作用的分子机制,通过脂质体转染的方法将携带X基因的真核表达载体pCMVX导入H7402肝癌细胞,使乙肝病毒x基因(HBx)瞬时过量表达.流式细胞仪检测结果显示,在瞬时转染3μgpCMVX质粒后,肝癌细胞发生凋亡.为阐明HBX诱导细胞凋亡的信号转导途径,对HBX与线粒体释放细胞色素c的关系做了初步探讨.通过罗丹明123染色,经流式细胞仪分析,显示在转染HBx基因后细胞线粒体膜电位明显下降,表明HBX可促进细胞色素c从线粒体释放增加.Western印迹检测结果显示,肝癌细胞在导入HBx基因后,细胞凋亡线粒体转导途径中细胞色素c、Apaf1、procaspase3和procaspase9等的表达水平均上调.研究结果说明,HBX可通过影响线粒体凋亡途径促进肝癌细胞凋亡.     

靶向Survivin基因与肿瘤

Survivin基因不仅表达于绝大多数的肿瘤细胞中,也存在于人体正常的细胞中,它具有抑制凋亡和调节有丝分裂的双重作用．临床研究表明：下调Survivin基因的表达或者抑制Survivin蛋白的功能,可以降低肿瘤细胞的生长潜力、增加凋亡的比例,而且可以增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物和放射线的敏感性．许多抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡而发挥功能．但某些肿瘤表现出对它们的耐药性。导致肿瘤耐药性的一个最重要的因素就是Survivin的表达．有关细胞凋亡途径和Survivin基因表达等方面的研究可为发现和发展新型抗肿瘤药物提供新的途径．     

线粒体参与介导MOPDO抑制HepG2细胞增殖、诱导其凋亡的作用

研究新合成的一氧化氮供体--核苷衍生物6-甲基-4-(2-氟-3,5-二-O-苯甲酰基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖)-[1,2,5]噁二唑[3,4-d]嘧啶-5(4H),7(6H)-二酮1-氧化物(MOPDO)抑制人肝癌细胞HepG2增殖、诱导凋亡的作用.以不同浓度的MOPDO作用于人肝癌细胞HepG2,MTT检测与相差显微镜观察相结合,分析MOPDO对HepG2细胞增殖的影响;膜联蛋白-V/PI双染检测细胞凋亡率;JC-1染色检测线粒体膜电位(△ψm)变化;硝酸酶法测定细胞培养液中NO的含量.结果发现,MOPDO以时间和剂量依赖性方式抑制HepG2细胞的增殖,细胞形态出现相应的变化;细胞凋亡率的增加呈时-效和量-效关系;JC-1染色显示,线粒体膜电位随着MOPDO剂量的增加降低;MOPDO释放的NO量呈剂量依赖性增加.表明线粒体可能参与介导MOPDO抑制HepG2细胞的增殖、诱导其凋亡的作用.     

马尾松树皮提取物体外诱导人肝癌细胞凋亡的一过性检测分析

目的研究马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extract, PMBE)对人肝癌细胞BEL-7402的体外诱导凋亡作用.方法运用"一过性细胞处理法",从形态、生化和分子水平检测细胞凋亡与否.结果 160μg/ml PMBE处理BEL-7402细胞24h后,凝胶电泳呈现DNA ladder,荧光镜检发现"核皱缩、边集或碎裂",流式细胞分析可见明显"凋亡峰".结论 PMBE能明显诱导体外培养的BEL-7402细胞凋亡;"一过性细胞处理法"能快速鉴定"凋亡"并测定"凋亡率",实现了定性与定量的统一.     

甘草乙醇浸提液诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

探讨甘草乙醇浸提液对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。经MTT法测定表明甘草乙醇浸提液对肝癌细胞SMMC-7721的半数致死浓度（IC50）为1．246mg／mL,细胞生长抑制率与甘草乙醇浸提液浓度呈正相关。作用后的癌细胞在Hoechst33342荧光染料作用下呈现草蓝色荧光,在形态上具有明显的细胞凋亡现象。提取其DNA进行琼脂糖凝胶电泳,出现明显的梯状条带。因此,甘草乙醇浸提液对肝癌细胞具有显著的抗增殖作用,它能够诱导肝癌细胞的凋亡。     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

表达乙型肝炎病毒表面抗原基因又形成多角体的杆状病毒

用形成包含体(OCC~+)并能利用人工合成启动序列和多角体XIV启动子表达外源基因的转移载体质粒pSXIVVI~+X3,将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因和多角体基因同时插入无包含体的粉纹夜蛾核型多角体病毒TnNPV-SVI-G基因组中,得到表达HBsAg基因又形成包含体(多角体)的重组毒侏TnNPV-HBs85-OCC~+。与利用野生型多角体启动子表达HBsAg基因的无包含体毒株TnNPV-HBsD4不同,TnNPV-HBs85-OCC~+由于具包含体,能以口服方式大规模感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫,且HBsAg基因在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞中的表达量要比前者高约37％,在虫体中的表达则更高。     

RMP在肝癌细胞基因组稳定性和凋亡中的作用

目的:研究RPB5调节蛋白(RMP)在正常肝细胞及肝癌细胞基因组稳定性中的作用,并探讨其与细胞凋亡的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从mRNA 水平检测正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP的表达。不同剂量⁶⁰Coγ射线照射肝癌细胞SMMC-7721细胞和正常肝细胞HL-7702细胞,RT-PCR法检测RMP的表达,流式细胞技术检测照射肝癌细胞周期变化及细胞凋亡。应用RNA干扰技术研究RMP在肝癌细胞基因组稳定性中的作用。结果:正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP基因均有不同程度的表达。经⁶⁰Coγ射线诱导的肝癌细胞及正常肝细胞RMP表达水平明显升高,且有一定剂量依赖性。随着照射剂量增加细胞凋亡明显增多,细胞周期G₁期增高,而S期明显降低。RMP被干扰后, 电子显微镜观察细胞形态发生明显改变,p21基因表达减弱。结论:RMP具有维持细胞基因组稳定性的潜在作用。RMP的表达与p53、p21等具有一定相关性,可能与后者协同调节细胞凋亡过程。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

磁性纳米粒子作用于肝癌细胞的生物学效应的研究进展

磁性纳米粒子,是一类智能型的纳米材料,因其特有的性质,被广泛应用于生物医学领域,在肝癌的治疗方面也有大量的实验性研究和成果。研究和探索磁性纳米粒子治疗肝癌的新方法和途径,有着很大的现实意义。本文就磁性纳米粒子作用于肝癌细胞的生物学效应的研究现状和进展进行总结整理,从三个方面进行了综述:磁性纳米粒子直接作用于肝癌细胞,探索磁性纳米粒子的生物相容性、在肝癌细胞的分布方式以及磁性纳米粒子本身对肝癌细胞的生物学效应的影响;磁性纳米粒子协同外加磁场(稳恒磁场、极低频交变磁场和高频交变磁场)作用于肝癌细胞;磁性纳米粒子外加修饰(磁性白蛋白纳米颗粒、纳米磁流体、磁性脂质体等),作为药物载体作用于肝癌细胞。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。