过表达miR-155抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:研究过表达miR-155对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响。方法:(1)用重组腺病毒Ad-BMP9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,定量PCR(qPCR)检测miR-155的表达,RT-PCR检测Runx2和ALP的表达。(2)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测miR-155的表达,ALP活性和染色检测早期成骨能力。(3)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,诱导分化14d茜素红S染色检测晚期成骨能力。(4)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN的表达。(5)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达。(6)qPCR和Western blot分别检测HIF1α和VEGF的mRNA表达水平和蛋白质表达水平。(7)应用荧光素酶报告基因对miR-155的靶基因进行筛选和验证。结果:在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,过表达miR-155降低ALP活性及染色;减少钙盐沉积;成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN表达降低;抑制p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达;HIF1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平减少。在对靶基因的检测中,过表达miR-155可以抑制HIF1α蛋白水平的表达,但对其mRNA水平无明显影响。结论:miR-155过表达减弱BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化,可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用,也有可能是通过抑制靶基因HIF1α的表达来发挥作用。     

Hmox1促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞向成骨分化

目的:研究血红素加氧酶1(hemeoxygenase 1,Hmox1)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导下间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化过程中发挥的作用。方法:用Ad-BMP9感染C3H10T1/2,分别用Q-PCR和Western blot检测Hmox1mRNA和蛋白水平的变化;Hmox1激动剂COPP处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定检测早期成骨指标ALP的变化;过表达Hmox1的重组腺病毒(Ad-Hmox1)处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,ALP染色和活性测定早期成骨指标ALP,茜素红染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,Western blot检测成骨相关基因COL1A1。结果:Ad-BMP9感染C3H10T1/2后,Hmox1的mRNA及蛋白水平均升高;BMP9与Hmox1激动剂COPP联用与BMP9组相比ALP的活性增强;Ad-Hmox1可以增强BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的ALP活性和钙盐沉积,以及成骨相关基因COL1A1表达。结论:Hmox1可以促进BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化。     

Hey1基因参与调控BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:观察发状分裂相关增强子Hey1在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果:Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达Hey1基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达Hey1基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化,并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论:Hey1基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。     

BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成脂肪分化的能力

探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂肪分化能力,为临床脂肪代谢疾病的治疗提供理论基础．培养多潜能的间充质干细胞C3H10T1/2,用20 μg/ml BMP2对其诱导一定时间后,RT-PCR检测是否存在BMP信号通路中关键分子BMP受体BMPR I, BMPR Ⅱ及Smad 1/5/8的表达.Western印迹检测Smad 蛋白及MAPK 信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT PCR检测成脂肪标志基因aP2以及成脂肪相关转录因子PPARγ,C/EBPα,C/EBPβ表达水平,同时用油红O染色,观测C3H10T1/2细胞成脂肪分化情况．经BMP2诱导后,C3H10T1/2细胞成脂肪分化标志(油红O染色)显著增加,Smad 蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成脂肪标志基因aP2以及成脂肪相关转录因子PPARγ,C/EBPα,C/EBPβ表达水平各有一定程度提高．BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成脂肪分化能力,其成脂肪分化呈现对BMP2作用的时间依赖性．     

BMP9经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

为了证实JNK激酶在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9) 诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用,利用重组腺病毒将BMP9导入间充质干细胞C3H10T1/2. 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定、钙盐沉积实验、荧光素酶报告基因检测、Western印迹和组织化学染色等方法,检测BMP9是否可经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.动物实验验证在RNA沉默JNK蛋白激酶后,对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化的影响．结果发现,BMP9可以增强JNK 激酶的磷酸化;利用JNK抑制剂SP600125抑制JNK激酶活性后,BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的早期成骨指标ALP活性和晚期指标钙盐沉积均受到抑制,而且经典SMAD信号的活化也相应受到抑制;RNA干扰沉默JNK基因表达后,同样也可抑制BMP9 诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性和裸鼠皮下异位成骨．因此表明,BMP9可活化JNK激酶途径从而诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化．     

孤儿核受体SHP敲减抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

孤儿核受体SHP(small heterodimer partner)是核受体超家族中的一员,具有LXXLL模体及配体结合域,但无经典的DNA结合域.它可与多种转录因子结合,调节细胞的增殖、分化和代谢等生物学过程.但目前关于SHP在BMP9诱导成骨分化中的确切作用却尚不清楚.本研究证明,SHP参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化. RT-PCR结合Western印迹方法检测蛋白揭示,异位表达BMP9上调了SHP在C3H10T1/2细胞中的表达. 小干扰RNA敲减SHP基因在C3H10T1/2细胞的表达下调了成骨相关基因Runx2、Id1、Id2及CTGF的表达,而过表达BMP9则可上调这些基因的表达.碱性磷酸酶(ALP)活性测定/染色及茜素红染色显示,敲减核受体SHP基因可抑制BMP9的成骨分化作用,而过表达BMP9可部分消除SHP 敲减导致的成骨抑制作用.上述结果提示,核受体SHP为BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化所必需. 究竟BMP9如何上调SHP基因表达,以及SHP究竟通过何种机制上调BMP9下游成骨分化相关基因的表达尚待进一步研究.     

RUNX2对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:研究和确认RUNX2在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:通过Western blot、RT-PCR、荧光素酶活性分析检测BMP9对RUNX2表达的影响;分别在过表达RUNX2和RNA干扰抑制RUNX2表达的情况下,利用碱性磷酸酶(ALP)活性测定和染色、钙盐沉积实验,免疫细胞化学和裸鼠皮下异位成骨实验分析RUNX2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果:BMP9可以促进RUNX2的表达;RUNX2体外可促进BMP9诱导的C3H10T1/2的ALP活性和钙盐沉积,却抑制了OCN表达,RUNX2还可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;而在降低RUNX2表达后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均受到抑制。结论:RUNX2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化。     

Runx1促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化

目的:研究Runx1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:用BMP9腺病毒感染MEFs细胞,利用RT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白质水平检测Runx1的内源性表达;构建过表达Runx1的重组腺病毒Ad-Runx1,并在mRNA和蛋白质水平验证Ad-Runx1的效果;用Ad-Runx1和BMP9条件培养基共处理MEFs,检测成骨早期指标碱性磷酸酶(ALP)染色和活性,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积;RT-PCR和Western blot分别检测成骨关键转录因子Runx2在mRNA和蛋白质水平的变化。结果:Ad-BMP9处理MEFs细胞后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;构建的Ad-Runx1处理MEFs后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;Ad-Runx1处理BMP9诱导的MEFs细胞后,增强了ALP活性和钙盐沉积以及Runx2在mRNA和蛋白质水平的表达。结论:Runx1可以促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化。     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

p38蛋白激酶参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:初步分析丝裂原活化蛋白激酶p38在BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用.方法:利用BMP9重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,Western blot检测p38激酶总蛋白表达水平和磷酸化水平.p38的特异性抑制剂SB203580抑制p38活性或RNA干扰抑制p38表达后,分析ALP活性...