霍乱弧菌染色体基因文库的构建

利用限制性内切酶Ｓａｎ３Ａ将霍乱弧菌１７８（埃尔托生物型,小川血清型）染色体ＤＮＡ进行部分酶切后,分离２０～５０ｋｂ的ＤＮＡ片断,与经过ＢａｍＨＩ酶切的柯斯质粒ｐＨＣ７９连接重组,通过体外包装系统形成噬菌体颗粒,感染受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１,构建成霍乱弧菌１７８染色体基因文库。为霍乱弧菌中未知基因的克隆及其它研究打下了基础。     

大麻哈鱼基因文库的构建及其生长激素基因的克隆

本文主要论述了黑龙江省特有鱼种,大麻哈鱼全基因文库的构建方法以及从所构建的1.9×10~(?)噬菌体成斑单位/ugDNA基因文库中克隆出生长激素基因片段的研究结果,作者使用DM-BL3入噬菌为载体,将大麻哈鱼肝总DNA的15-20Kb片段重组到载体中,再包装成新的重组噬菌体,以含虹鳟鱼生长激素DNA部分序列的PAF51为探针,经[~(12)P]dCTP标记后,与噬菌斑杂交,自显影,获得3个阳性斑,复筛获得90％以上阳性斑,酶切回收生长激素基因片段,实验证明,已成功地获得大麻哈鱼生长激素基因片段,可供进一步亚克隆或转移研究使用。     

水稻基因文库的构建

本文以λ系列EMBL4DNA作载体,在国内条件下建成了水稻(Oryza sativa)“Mudgo”褐稻虱抗性品种(λMBL4／OSM(Bam-Sau3A)]和“南粳15”水稻白叶枯病抗性品种[λ—EMBL4/OSNG15(Bam-Sau3A]的两个基因文库。所得重组子值分别为1．6×10⁶pfu和9．6×10⁶pfu,均超过了建库要求的理论值。     

构建胆固醇氧化酶的短杆菌基因文库

以内切酶Sau3AI部分水解产胆固醇氧化酶短杆菌的染色体DNA,以质粒pUC18为载体,JM109为宿主,采用碱性磷酸酯酶CIP去除内切酶BamHI水解后质粒的5’端磷酸根,提高质粒的重组率,构建了供筛选胆固醇氧化酶基因的基因文库     

我国的野生大豆

野生大豆种子的蛋白质含量极高。近十年来对其多方面研究证明,它具有很高的育种利用价值,是我国极重要的蛋白基因资源。本文概要介绍我国野生大豆的分布、种类及特征、特性等基本情况。     

水稻叶绿体基因文库的构建和精细限制图谱的制作

水稻幼叶在加有高浓度抗坏血酸的缓冲液中匀浆,以获得完整的叶绿体,从中分离到ctDNA得率高达100μg/100g叶,纯度足以用于限制性核酸内切酶分析。ctDNA经Mbo I部分酶解得到的片段克隆到载体pcos 2 EMBL的Bam HI位点,重组DNA经体外包装后感染宿主菌,筛选表型Tc~5Km~R的重组子,通过计数克隆有效率达5×10~4重组菌落/1微克插入DNA。用λ-末端酶对重组环状双链DNA在cos位点切成线性分子,产生两个(ON-L及ON-R)可供标记和杂交的末端,线性Cosmid DNA经限制酶部分消化,凝胶电泳分离,干燥凝胶放射自显影,得到了6种限制性核酸内切酶的限制图谱。水稻ctDNA全长为129.5kb,在ctDNA上Pvu Ⅱ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、Eco RI及Bam HI的切点分别为11、12、17、37、67和44个,1R A和B为21.7kb,LSC为73.7kb,SSC为12.4kb。     

野生大豆种子cDNA文库的构建与分析

为了分离与鉴定野生大豆优良基因,以双高型优质野生大豆的近成熟种子为材料,采用裂解法提取了总RNA;以Oligo（dT）为引物,经SA—PMPS法分离出mRNA,反转录酶催化合成cDNA,并以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二链,双链cDNA经加接头等步骤,成功构建了野生大豆cDNA文库。文库的重组率约为93．7％,PCR检测重组克隆的插入片段平均大于1000bp,测序片断大于500bp,表明构建的近成熟种子cDNA文库质量较高,为进一步进行EST测序和全长克隆打下了基础。     

雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定

本研究以雨生红球藻34-1n为材料,提取其基因组DNA,利用限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行酶解,回收6~8kb的基因组DNA片段,并浓缩至200ng/μL。该片段与经BamH Ⅰ酶切和去磷酸化处理后的pUC18载体连接,然后电击转化到受体菌Escherichia.coli DH5α中,获得雨生红球藻34-1n的基因组文库。该文库的平均插入片段长度约为6.5kb,获得6×105个克隆数。通过PCR筛选,由雨生红球藻基因组文库中获得含bkt1序列的单克隆菌,与β-胡萝卜素氧化酶序列(GenBank:DQ086233.1)进行比对,结果表明bkt1基因组序列含有6个外显子。本研究为进一步鉴定雨生红球藻相关基因提供了一个文库平台。     

野生大豆光温反应规律的研究

野生大豆（G .Soja）是栽培大豆的近缘祖光种,利用中国野生大豆分布的广泛性,为我们了解和认识大豆在自然界中光温反应的规律提供了条件。通过对29个纬度区自然生长的野生大豆主要生育阶段光温反应特点的了解,明确了不同纬度区野生大豆在自然环境中出苗温度是13.1～14.7℃,开花期温度是20.5～26.5℃,成熟期温度是10～19℃;初花期临界光照时数是13h15min至16h40min之间。出苗越早的低纬度区野生大豆开花和成熟期越晚,而出苗越晚的高纬度区野生大豆开化和成熟期越早。     

龙葵抗阿特拉津生物型叶绿体基因文库的建立

用对阿特拉津(Atrazine)除草剂抗性的龙葵生物型B_(12)株系作材料,制备叶绿体DNA。B_(12)株ctDNA(叶绿体DNA)经BamHI酶解,在0.7％琼脂糖凝胶电泳上呈现24条带,其中最大的片段为18.6kb,最小的片段为1kb。用pBR322作为载体,构建B_(12)株ctDNA BamHI片段文库。通过与探针的分子杂交,从中筛选出含有编码叶绿体32kd蛋白质的阿特拉津抗性基因的克隆pSB135和含有ATP合酶α亚单位基因的克隆pSB132。     

红脐鳞地衣基因组文库的构建

地衣是真菌和一种或多种光合微生物形成的稳定的共生联合体 ,既是先锋生物 ,又是敏感生物。环境的变化及生境的片断化 ,使得许多地衣种类处于濒危状态。保护珍稀濒危地衣物种的方法包括地衣体的移植 ,地衣中菌藻的分离培养及基因组文库的构建等。本研究用改进的CTAB方法提取基因组总DNA ,以Lamb daGEM 11为载体 ,构建了红脐鳞 (Rhizoplacachrysoleuca)的基因组文库 ,文库中同时含有该地衣共生菌与共生藻的DNA。该文库包含 8.5× 10 5个重组子 ,插入片段的平均大小为 19kb。文库的容量约为红脐鳞单倍体基因组的 10 0倍。该基因组文库的构建为保护稀有与濒危地衣物种提供了一个新的途径 ,并可进一步开展有关地衣的分子操作研究 ,如地衣冰核蛋白的异源表达等。     

毛足棒角蝗基因组DNA文库的构建

纯化毛足棒角蝗 (Dasyhippusbarbipes)虫体组织的高分子量基因组DNA ,经限制性内切酶Sau3AI部分消化后 ,10 %～ 4 0 %蔗糖密度梯度离心分离 10～ 2 0kb的DNA片段。以λEMBL3为克隆载体 ,与 10～ 2 0kb的DNA片段进行连接和包装 ,构建了毛足棒角蝗的基因组DNA文库。经测定该文库的滴度是 2× 10 5pfu/mL ,根据计算 ,99%的毛足棒角蝗的基因包含在该基因组文库中。     

利用一碳化合物(C1)细菌的分离及基因组文库的构建

从污水样品中筛选到能利用甲醇的菌株B,经16SrDNA测序分析鉴定为肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumo-niae)。甲醛耐受能力的测试表明该菌对甲醛具有较强耐受能力,能在含有8￣15mmol/L甲醛的LB培养基上生长。Southern杂交分析说明这菌株的基因组中有甲基营养菌6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列。本研究以pUC118为载体构建了基因组文库,进一步检测结果说明所构建的基因组文库质量符合要求。     

伪狂犬病毒闽A株基因文库的构建及物理图谱分析

本文报道以质粒ｐＢＲ３２２作载体,用鸟枪法克隆出了ＰＲＶ闽Ａ株除ＢａｍＨＩ－１,２外的所有酶切片段,构建了ＰＲＶ闽Ａ株基因文库,并以克隆出的ＢａｍＨＩ片段用光生物素标记作探针,应用分子杂交法确定了ＰＲＶ闽Ａ株绝大部分限制性内切酶位点的位置。     

江西野生大豆遗传多样性分析

利用48个SSR分子标记分析了192份采集于江西49个县（区）的野生大豆遗传多样性。结果表明,共扩增出等位基因343个,平均每对引物扩增出7.2个等位基因,平均基因遗传多样性指数0.7369,平均多态性信息含量（PIC）0.7060,表明江西野生大豆具有较为丰富的遗传多样性。不同纬度和不同海拔的野生大豆其遗传多样性不同,高纬度及低海拔地区野生大豆遗传多样性要高。192份野生大豆可聚类成三大类,聚类结果与地理来源较为一致。     

基因组文库构建及其在保护遗传学中的应用前景

基因组文库是进行分子克隆和基因组结构与功能研究的基础。完整的基因组文库的构建, 使任何DNA 片段的筛选和获得成为可能。随着不同克隆载体的相继出现, 基因组文库也经历了一系列的发展过程。其中, BAC文库因其转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收, 以及容载量较大等优点而被广泛应用。近几十年来, 随着环境的日益恶化、分子遗传学技术的迅速发展, 以及保护生物学和分子遗传学的不断相互渗透, 孕育产生了保护遗传学这一分支学科。作为保护遗传学中物种保护策略的重要部分, 建立濒危野生动植物的基因组文库, 是保存其种质资源的最为有效的实际手段和方法, 并能为进一步开展与生殖、疾病和重要经济性状等方面有关的功能基因的研究, 提供可靠的材料保证。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。