中华按蚊CYP6Y亚家族基因的鉴定和生物信息学分析

【目的】鉴定中华按蚊Anopheles sinensis CYP6Y亚家族基因,分析它们的结构和特征,推测其可能的功能。【方法】以冈比亚按蚊An. gambiae CYP6Y1作为询问序列,通过双向Blast方法检索中华按蚊转录组中CYP6Y亚家族基因,并通过生物信息学方法分析基因结构、特征及可能的功能。【结果】从中华按蚊转录组测序数据中鉴定出2条CYP6Y亚家族基因,分别命名为AsCYP6Y1（GenBank登录号：KF709397）和AsCYP6Y2（GenBank登录号：KF709398）。序列分析显示,AsCYP6Y1和AsCYP6Y2全长分别为1 713 bp和1 815 bp,分别编码502和526个氨基酸。基因结构分析显示,该亚家族基因仅含有1个相位1型内含子并与其他P450基因形成保守的共线性分布。蛋白结构分析显示,这2个基因编码的蛋白含P450特有的5个特征序列和6个底物结合位点,且均不存在信号肽,其亚细胞定位为细胞质。3D结构分析显示,AsCYP6Y1有18条α螺旋和13股反向平行的β折叠,AsCYP6Y2有19条α螺旋和11股反向平行的β折叠。通过同样的方法,在达林按蚊An. darlingi中也鉴定出2个CYP6Y亚家族基因。系统进化分析显示,AsCYP6Y1和AsCYP6Y2分别与其他3种按蚊的CYP6Y1和CYP6Y2聚成一支,Bootstrap值均大于90%。替换率分析显示,中华按蚊AsCYP6Y1和AsCYP6Y2与其他3种按蚊同源基因的Ka/Ks均小于1。相对进化速率分析显示,中华按蚊CYP6Y和CYP6M亚家族的相对进化速率均显著快于CYP6P亚家族,而CYP6Y和CYP6M亚家族之间没有显著差异。【结论】在中华按蚊和达林按蚊中存在2个CYP6Y亚家族基因,之前在冈比亚按蚊和不吉按蚊An. funestus中也发现2个CYP6Y亚家族基因,表明CYP6Y亚家族基因可能在按蚊属广泛存在,且可能为按蚊属昆虫所特有。     

我国白纹伊蚊对三种拟除虫菊酯类杀虫剂抗性检测诊断剂量的建立

【目的】建立中国白纹伊蚊Aedes albopictus成蚊对溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯杀虫剂抗性检测的诊断剂量。【方法】应用溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯原药制作不同浓度的药膜滤纸,接触筒法测定白纹伊蚊实验室敏感品系成蚊对3种拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,记录1 h的击倒数和24 h的死亡数。应用Excel 2007和SPSS20.0进行数据统计处理,并制作杀虫剂的毒力回归线,计算各自的LC_(50)和LC_(99)值。以2倍LC_(99)值作为区分抗性和敏感种群的诊断剂量,制作药膜滤纸,接触筒法生物测定海口市白纹伊蚊现场种群成蚊对杀虫剂的抗药性。【结果】溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯和氯菊酯杀虫剂对白纹伊蚊实验室敏感品系成蚊的LC_(50)值分别为0.00619%,0.01403%和0.05009%,LC_(99)值分别为0.05175%,0.11859%,和0.53165%,相对应的诊断剂量分别为0.1035%,0.2372%和1.0633%。应用上述溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯诊断剂量测定的海口市白纹伊蚊现场种群的死亡率分别为22.58%,36.29%和40.83%,表明该种群对这3种菊酯类杀虫剂均已产生了抗性。【结论】本研究建立的白纹伊蚊对3种拟除虫菊酯类杀虫剂的诊断剂量可作为该蚊成蚊抗药性监测的参考。     

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。     

星豹蛛四个羧酸酯酶基因克隆及溴氰菊酯胁迫下的表达模式

【目的】探究星豹蛛Pardosa astrigera羧酸酯酶基因PaCarE1-4是否与其代谢溴氰菊酯有关。【方法】采用RT-PCR技术克隆星豹蛛4个羧酸酯酶基因PaCarE1-4 cDNA序列,通过生物信息学软件分析其序列特性。采用RT-qPCR技术测定这4个羧酸酯酶基因在星豹蛛雌雄成蛛不同组织(头胸部、腹部和足)以及在不同浓度(LC₁₀=5.151 mg/L; LC₃₀=8.619 mg/L; LC₅₀=12.311 mg/L)溴氰菊酯胁迫12 h和LC₃₀浓度溴氰菊酯胁迫2, 4, 8, 12, 24和48 h雄成蛛中的相对表达水平。【结果】克隆获得星豹蛛羧酸酯酶基因PaCarE1-4(GenBank登录号分别为MZ643212, MZ643214, MZ643215和 MZ643216)的全长cDNA序列,开放阅读框(ORF)分别长1 653, 1 803, 1 827和1 818 bp,分别编码550, 600, 608和605个氨基酸。组织表达谱结果表明,PaCarE1和PaCarE2在星豹蛛雌雄成蛛腹部中的表达量最高,且在雄成蛛腹部中的表达量高于雌成蛛中的;PaCarE3和PaCarE4在雌雄成蛛头胸部中的表达量最高,且PaCarE3在雌成蛛头胸部中的表达量高于雄成蛛中的,PaCarE4在雄成蛛头胸部中的表达量高于雌成蛛中的。LC₃₀浓度溴氰菊酯胁迫12 h诱导了星豹蛛雄成蛛中PaCarE1的表达,LC₁₀和LC₃₀浓度溴氰菊酯胁迫12 h诱导了PaCarE2的表达。LC₃₀浓度溴氰菊酯胁迫不同时间后,与对照组(丙酮处理组)相比,星豹蛛雄成蛛中PaCarE4的表达量与对照组均无显著差异,而PaCarE1的表达量在处理后2, 8和12 h, PaCarE2的表达量在处理后12 h,以及PaCarE3的表达量在处理后24 h显著上调。【结论】羧酸酯酶基因PaCarE1, PaCarE2和PaCarE3可以被溴氰菊酯诱导表达,表明其可能参与星豹蛛对溴氰菊酯的代谢过程。本研究结果有助于了解星豹蛛对外源物质的代谢机理,为这一捕食性天敌的保护提供了新思路。     

RNAi沉默王浆主蛋白1(Mrjp1)基因对意大利蜜蜂工蜂学习和记忆的影响

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1, MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜蜂学习能力。本研究旨在采用RNA干扰(RNAinference, RNAi)技术将Mrjp1特异性沉默,验证MRJP1在意蜂工蜂嗅觉学习中的关键作用。【方法】通过克隆技术获得Mrjp1基因cDNA 序列,经测序验证后,设计引物,合成用于RNAi干扰Mrjp1基因表达的dsRNA。注射dsMrjp1的意蜂工蜂作为处理组(dsMrjp1注射组),注射dsEGFP的意蜂工蜂作为对照组(dsEGFP注射组),随后通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)实验比较两组的嗅觉学习与记忆能力差异。最后采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测注射dsMrjp1后意大利蜜蜂工蜂脑中Mrjp1的相对表达量。【结果】dsMrjp1注射组与dsEGFP注射组意蜂工蜂学习能力差异显著,dsMrjp1注射组意蜂工蜂的学习能力显著降低。学习后2 h,两组意蜂工蜂的记忆力无显著差异。qRT-PCR结果显示Mrjp1的表达水平在dsMrjp1注射组意蜂工蜂脑中显著低于dsEGFP注射组,表明学习能力降低的处理组意蜂脑内对应的Mrjp1表达水平也降低。【结论】通过RNAi抑制意蜂工蜂Mrjp1基因的表达后,其嗅觉学习能力受到显著性抑制,但记忆力未受到显著影响,提示Mrjp1可能是调控意蜂学习的重要基因之一。本研究结果有助于后续进一步研究蜜蜂嗅觉学习相关的分子机制。     

中华按蚊含LY结构域的胰蛋白酶基因的分子特征及表达模式分析

【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis 含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊An. gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊Culex quinquefasciatus胰蛋白酶家族基因的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组中胰蛋白酶基因,将中华按蚊LY-trypsin基因依据其结构域特征及系统发生关系进行命名LY-trypsin。运用生物信息学方法预测中华按蚊LY-trypsin基因的结构、在scaffold的定位、结构域、系统发育关系,及其在中华按蚊不同发育时期、成蚊不同组织和吸血前后雌成蚊中的表达模式。【结果】在中华按蚊全基因组上共鉴定得到27个中华按蚊LY-trypsin基因;在黑腹果蝇、冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊基因组中未鉴定到LY-trypsin基因。中华按蚊27个LY-trypsin基因分别编码329~1 125个氨基酸,分子量在36.8~125.5 kD之间,等电点在4.73~8.94间。其中, 20个LY-trypsin具有信号肽,信号肽长度在10~62个氨基酸之间。这27个中华按蚊LY-trypsin基因的外显子数为1~5个,内含子长62~20 093 bp。这27个中华按蚊LY-trypsin基因被定位在11个scaffold上,其编码蛋白均有YWTD保守基序(LY基序);其中16个LY-trypsin基因所编码的氨基酸序列具有含丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的活性位点。系统发育结果表明,27个中华按蚊LY-trypsin基因聚类为4个分支。在不同发育阶段,半数以上的中华按蚊LY-trypsin基因显示出相似的表达模式,在幼虫阶段均高水平表达;在中华按蚊不同成蚊组织中,LY-trypsin基因均有不同程度的表达;吸血前后雌蚊中仅有个别基因表达,并未发现表达特异性。【结论】本研究在中华按蚊基因组中首次鉴定出LY trypsin基因,并揭示了这些LY-trypsin基因的分子特征和表达模式,为LY-trypsin基因的进一步研究提供了信息框架。     

棉铃虫剂量补偿相关基因Hamsl1的鉴定与功能分析

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera的剂量补偿(dosage compensation, DC)分子机制尚不清楚。本研究旨在通过克隆棉铃虫雄性特异性致死(male specific lethal, msl) 基因Hamsl1,利用RNA干扰技术明确其是否参与调控棉铃虫剂量补偿。【方法】利用RT-PCR同源克隆棉铃虫Hamsl1基因全长cDNA; 利用qPCR技术研究Hamsl1基因在棉铃虫不同发育时期的表达谱;通过显微注射Hamsl1 siRNA到棉铃虫3龄幼虫中对Hamsl1基因进行RNA干扰后,利用qPCR技术检测15个Z染色体基因的表达情况,分析Hamsl1是否调控Z染色体基因剂量。【结果】成功克隆了棉铃虫Hamsl1基因的cDNA序列,鉴定出Hamsl1基因mRNA存在2种剪接体,分别命名为Hamsl1a(GenBank登录号: MK564008)和Hamsl1b(GenBank登录号: MK564009)。功能域分析发现HaMSL1含有典型的PEHE和coiled-coil功能域,具有MSL1蛋白的特征。qPCR分析表明,Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上;棉铃虫Hamsl1a与Hamsl1b基因表达均具有发育时期特异性,在成虫期表达量最高,且雌雄化蛹后基因表达量差异显著,具有性别特异性。通过同源比对和qPCR分析,在DNA水平鉴定了15个Z染色体候选基因。显微注射Hamsl1 siRNA于3龄幼虫体内72 h,干扰效率为36.01%~64.27%,并未发生雄性致死现象;与对照组相比,Hamsl1 RNAi处理组中棉铃虫15个Z染色体基因在雄性个体中整体呈现表达量上调趋势,而在雌性个体中平均表达水平差异不显著。【结论】本研究初步探明Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上,且该基因可能通过抑制雄性棉铃虫Z染色体基因表达,调控棉铃虫Z染色体剂量补偿。本研究为深入研究棉铃虫剂量补偿分子机制和绿色防控棉铃虫提供了理论基础。     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与序列分析

用逆Northern印迹和Northern印迹法进一步鉴定淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性品系胰蛋白酶的表达差异 ,结果显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中的表达量分别是敏感性品系的 4.3和 3.9倍。采用RACE法筛选cDNA文库 ,获得总长度为 90 9bp的淡色库蚊胰蛋白酶基因的全长序列 ,其中开放阅读框为 786bp ,推导出编码 2 6 1个氨基酸的蛋白质 (GenBank/NCBIAY0 34 0 6 0 ) ,其与冈比亚按蚊胰蛋白酶同源性最高 ,为 5 5 %     

中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

灰飞虱羧酸酯酶LsCarE1介导杀虫剂抗性

【目的】我们前期的研究发现,在灰飞虱Laodelphax striatellus抗毒死蜱品系、抗吡虫啉品系和抗溴氰菊酯品系中的总酯酶活力都明显升高。本研究旨在筛选导致总酯酶活力升高的酯酶基因并验证其在抗药性中的作用。【方法】通过转录组测序和RT-qPCR比较抗、感灰飞虱品系雌成虫中各个酯酶基因的表达量;采用显微注射技术建立超量表达灰飞虱羧酸酯酶基因的果蝇品系;并利用生物测定技术检测过量表达灰飞虱酯酶基因的果蝇对毒死蜱、吡虫啉和溴氰菊酯的敏感性。【结果】通过转录组数据和RT-q PCR筛选到羧酸酯酶基因LsCarE1(Gen Bank登录号:HM600723)在3个灰飞虱抗性品系中均过量表达。将LsCarE1基因按黑腹果蝇Drosophila melanogaster偏好的密码子优化后构建转基因载体质粒pUAST-att B-LsCarE1~(Optimized),成功建立纯合的转基因果蝇品系UAS-LsCarE1~(Optimized)。利用GAL4启动品系da-gal4与UAS-LsCarE1~(Optimized)品系杂交,获得超量表达LsCarE1的果蝇品系daLsCarE1~(Optimized)。定量PCR检测发现,目标基因LsCarE1在超量表达品系daLsCarE1~(Optimized)中的表达量是对照品系UAS-LsCarE1~(Optimized)中表达量的257.3倍;而另一对照品系dagal4中没有检测到LsCarE1的表达。此外,黑腹果蝇内源的酯酶同源基因表达量显著低于目标基因的表达量。生物测定结果显示,与对照组dagal4果蝇品系相比,启动超量表达LsCarE1的转基因果蝇daLsCarE1~(Optimized)对毒死蜱和吡虫啉的耐药性分别提高了4.19和2.46倍,但对溴氰菊酯的耐药性无显著变化。【结论】LsCarE1的过量表达与灰飞虱对毒死蜱和吡虫啉的抗性相关。     

烟粉虱MED隐种钙离子结合蛋白基因的RNAi及其生物学效应

【目的】前期研究发现烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种2个钙离子结合蛋白(BtCaBP1和BtCaBP2)参与烟粉虱对溴氰虫酰胺的应激反应。本研究旨在通过RNAi干扰钙离子结合蛋白基因,系统揭示钙离子结合蛋白对烟粉虱的生物学影响。【方法】通过dsRNA饲喂法分别干扰烟粉虱MED隐种成虫钙离子结合蛋白基因BtCaBP 1和BtCaBP 2后,qPCR检测BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量;观测并比较了RNAi 3 d后处理组(分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 2)和对照组(饲喂ds EGFP)间烟粉虱MED隐种亲代成虫(雌雄)寿命、单雌产卵量以及子一代的卵孵化率和成虫前期发育历期等生物学参数。【结果】分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 23 d后,处理组烟粉虱MED隐种靶标基因BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量较对照组均显著降低。处理组中干扰BtCaBP 2后的亲代烟粉虱MED隐种成虫寿命(雌:15.46±1.24 d;雄:13.84±0.38 d)较对照组的(雌:13.25±0.58 d;雄:12.67±0.65 d)显著延长;处理组的单雌产卵量(39.53±3.04)比对照组的(76.06±4.76)显著降低;处理组子一代卵孵化率(81.58%±4.42%)比对照组的(87.22%±3.21%)显著降低;子一代成虫前期发育历期处理组(24.42±1.09 d)比对照组的(27.52±1.73 d)显著缩短。而干扰BtCaBP 1基因后,亲代及子一代上述生物学参数没有显著变化。【结论】干扰BtCaBP 1和BtCaBP 2对烟粉虱MED隐种具有不同的生物学效应,该结果为后续进一步研究钙离子结合蛋白的生物学功能提供了参考。     

RNAi抑制小菜蛾Br-Z2/3基因对下游细胞凋亡基因表达及化蛹的影响

[目的]本研究旨在构建用于小菜蛾Plutella xylostella蛹期特异表达基因Br-Z2/3 dsRNA合成的体外原核表达系统,研究RNAi抑制Br-Z2/3基因对小菜蛾Br-Z2/3和细胞凋亡基因表达及化蛹的影响.[方法]构建小菜蛾L4440-Br-Z2/3重组载体,转化大肠杆菌Escherichia col...     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

甜菜夜蛾肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能。【方法】利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达。通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后,qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin, Attacin和Defensin)和细菌载量的变化。RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后,以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0, 24, 48, 72, 96和120 h,计算幼虫校正死亡率;饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫Bt-GS57后0, 24, 48和72 h,利用qRT-PCR检测中肠SePGRP-SA, Ceropin, Attacin和Defensin的相对表达量。【结果】克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号：MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸,其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD。序列分析结果表明,SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域,信号肽为19个氨基酸,为分泌型蛋白;系统进化分析发现,SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的SlPGRP亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达91.1%。发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达;组织表达谱结果表明,SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达,其中以血淋巴中表达量最高。与注射dsEGFP(对照)相比,注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了95.26%,Cecropin, Attacin和Defensin表达量显著下调,中肠细菌载量显著升高。注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00%和73.33%,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加。甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后,中肠SePGRP-SA, Cecropin, Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加,72 h时降低。【结论】Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin, Attacin和Defensin的表达。     

烟草甲谷胱甘肽S-转移酶基因LsGSTe1的表达及其与甲酸乙酯耐受性的关系

【目的】探究烟草甲Lasioderma serricorne谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)基因LsGSTe1的分子特性和生物学功能。【方法】在烟草甲转录组数据的基础上,利用RT-PCR技术扩增LsGSTe1基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR技术检测LsGSTe1在烟草甲不同发育阶段(低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫、高龄成虫)及高龄幼虫不同组织(表皮、中肠、脂肪体、马氏管)中的表达水平,以及在甲酸乙酯熏蒸胁迫后的5龄幼虫中的表达变化。进一步采用RNAi技术沉默烟草甲5龄幼虫LsGSTe1基因,通过生物测定分析烟草甲对熏蒸剂甲酸乙酯的敏感性变化。【结果】获得LsGSTe1基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:MN480468),开放阅读框长684 bp,编码227个氨基酸,N端和C端均存在催化保守位点。系统发育分析表明该基因属于GSTs的Epsilon家族。qPCR结果表明,LsGSTe1在烟草甲不同发育阶段均有表达,且在高龄幼虫期的表达量较高;表达部位主要在幼虫脂肪体,其次为中肠和表皮,而在马氏管中的表达量最低。LC_(30)(10μL/L)和LC_(50)(20μL/L)浓度的甲酸乙酯对烟草甲5龄幼虫熏蒸胁迫后,LsGSTe1的表达水平显著升高,分别是对照组的2.96和5.80倍。RNAi结果发现,RNAi 48 h和72 h后,LsGSTe1的表达量分别下降了79.9%和83.0%,沉默效率显著;RNAi 72 h后,dsLsGSTe1注射组与对照(dsGFP组)相比,LC_(50)浓度的甲酸乙酯处理5龄幼虫的死亡率明显提高了32.4%。【结论】推测LsGSTe1基因可能参与了烟草甲对甲酸乙酯的代谢与解毒过程。