AB5肠毒素A、B亚基比例表达调控机理的研究

霍乱毒素（ＣＴ）及大肠杆菌势不稳定甩的毒素（ＬＴ）的Ｂ亚基基因的表达水平是Ａ亚基的５￣７倍,研究发现Ａ基因内部存在着１个８０ｂｐ长的翻译控区,含有３个翻译起始序列（ＴＩＲ）,其第２个翻译起始序列的终止密码与第３个翻译起始序列的起始序列的起始密码重叠,因而形成翻译偶联,继续翻译至Ａ基因的终止密码。将ＴＩＲ３的超始密码ＡＴＧ突变为ＡＴＣ后ＴＩＲ２及ＴＩＲ３失去功能,这时下游报告基因（类似于ｃｔｘＡ、Ｂ     

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ｃｔｘ Ｂ基因上游Ａ基因部分序列对ｃｔｘＢ表达水平的影响,结果表明：（１）将霍乱毒素操纵子ＸｂａＩ－ＥｃｏＲｉ片段克隆至ｐＵＣ１９,构建的质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ中Ａ亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠菌后的ＣＴＢ的表达产量为３０μｇ／μｌ;（２）在质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ的ＸｂａＩ位点引入移码突变,构建质粒ｐＭＣ０２Ｃ,使Ａ亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码,Ｂ     

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctxB基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将ctx操纵子XbaI—EcoRI片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠杆菌后CTB的表达产量为30μg/ml;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,这时A亚基的部分序列的阅读框架与lacZ一致,从而A基因能够翻译至自然的终止密码,B基因的表达水平却降低一倍;(3)质粒pUC19CTB缺失XbaI～ClaI(550bp)的非翻译序列,构建质粒pMC03(A亚基序列不翻译),该质粒转化大肠杆菌后ctxB基因的表达水平降低1倍;(4)在质粒pMC03中ctxB基因上游引入移码突变,构建的质粒pMC03C(ctxB上游基因能够表达)CTB的表达水平较pMCO3低得多,较pUC19CTB低20倍以上。对产生上述现象的原因进行了分析讨论。     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达载体的构建

采用PCR技术将霍乱弧菌CTB基因的终止密码子定点突变并引入一个EcoR Ⅰ位点,然后与人工合成的Linker连接,构建成了新颖的融合蛋白表达载体。在CTB 3′端的Linker上有四个单一人酶切位点,在任何限制性位点融合外源基因序列后,都可在3′端形成转译终止密码子。     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３＇端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ＰＭＣ０５,ＰＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ＇基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋白具有ＣＴＢ的抗原性。以上结果表明：通过将外源抗原决定簇基因融合至ｃｔｘＢ的３′端,在大肠杆菌中表达融合蛋白,构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响,构建了高效表达融合蛋白的载体－宿主系统。     

霍乱毒素B亚基与疟原虫多价抗原的融合、表达及免疫原性研究

疟疾是严重威胁人类身体健康的疾病,全世界每年有300万人死于疟疾,因此研究有效的疟疾疫苗具有重要意义。但是由于疟原虫生活史十分复杂,给人疟疾疫苗研究带来了很大困难。一度呼声颇高的Spf66疫苗在大量的人体试验结果表明其保护效率低,其主要原因可能是Spf66为小肽,其免疫原性不强,因此使用合适的佐剂是提高疟疾疫苗免疫原性和保护效率的途径。美国Water Reed陆军医学研究所应用乙肝表面抗原为佐剂,研制的疟疾疫苗显著提高了保护效果。 霍乱毒素是良好的疫苗载体和免疫佐剂。本研究首先构建了适于将抗原表位基因融合在     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素Ｂ亚基基因上游ＸｂａＩ～ＣｌａＩ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素Ｂ亚基表达水平可达２００ｍｇ／Ｌ,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在０．３～１０ｍｇ／Ｌ之间,大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的表达量达４１００单位／ｍｌ。在该启动子的控制下霍乱毒素Ｂ亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素Ｂ亚基表达量是Ａ亚基的６倍的原因。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素B亚基基因上游Xba Ⅰ～Cla Ⅰ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素B亚基表达水平可达200mg/L,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在0.3～10mg/L之间,大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的表达量达4100U/ml。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是由于霍乱毒素操纵子中霍乱毒素B亚基表达量是A亚基的6倍。     

CS3菌毛抗原和霍乱毒素B亚基在人伤寒菌中的表达

通过体内外重组的方法,构建了人伤寒菌流行株Ｔｙ２的△ａｒｏＡ,△ａｒｏＣ和ａｓｄ＾－基因缺失突变体（ＲＳ４１７）作为抗原载体菌：同时,构建包含ａｓｄ基因的表达质粒ｐＹＸ１０２,与ＲＳ４１７一起,构成宿主－载全平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因,将肠毒素性大肠杆菌的菌毛抗原ＩＩＩ（ＣＳ３）基因和霍乱弧菌毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因分别克隆至ｐＹＸ１０２     

乙肝PreS2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒前Ｓ２抗原抗原决定簇基因,与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３＇端融合,重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达３０μｇｍＬ,表达产物９５％以上分泌到胞外,表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持了霍乱霉素Ｂ亚基的基本高级结构和生物学功能;酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

本研究通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了HBV PreS_2抗原决定簇基因,与ctxB基因的3’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达30μg/ml,表达产物95％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂GM1结合,说明融合蛋白保持了CTB的基本高级结构和生物学功能;ELISA实验证明融合蛋白具有CTB和HBV PreS_2的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白的免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因,与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达３０μｇ／ｍＬ,表达产物９５％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持了霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）的基本高级结构和生物学功能;酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

A组轮状病毒VP6与霍乱毒素B亚基融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

利用霍乱毒素B亚基 (CholeratoxinBsubunit,CTB)的免疫载体作用 ,将轮状病毒相关抗原引入口服免疫体系 ,可激起有效的粘膜免疫反应 ,这里报道了CTB基因与A组轮状病毒地方株T114VP6全基因的融合 ,并在大肠杆菌BL21(DE3 )中进行了融合蛋白的表达。在IPTG诱导下得到分子量为 5 6kD的融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的15 %。分别用抗CT的抗体和抗A组轮状病毒的高价免疫血清进行WesternBlot检测 ,结果证明融合蛋白CTB VP6保留了天然霍乱毒素B亚基及轮状病毒VP6的抗原性。G_M1-ELISA检测表明 ,复性后的融合蛋白具有与神经节苷脂GM1 结合的能力。     

转基因烟草表达霍乱毒素B亚单位的研究

将霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）基因克隆到质粒ｐＢｉｎ４３８中,分别构建植物表达载体ｐＢＩ－ＣＴＢ、ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ。采用叶盘法分别转化烟草Ｋ３２６,各表达载体得到了一批较基因植株。转基因烟草的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ＣＴＢ基因整合到了烟草基因组中。转基因植株的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ的转基因植株能有效表     

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗原性

通过固相化学合成法,合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因,这些抗原决定簇基因片段以不同方式串朕后与ｃｔｘＢ基因融合,构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量随所融合的抗原决定簇不同在１０～５０μｇ／ｍｌ之间,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化达到了电泳纯。对１１种融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇的反应原性的研究表明,多数融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇均能与对应的ＨＣＶ抗体结合。其中以融合蛋白９５０８２为抗原研制的抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂具有良好的灵敏度和特异性。     

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗…

通过固相化学合成法,合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因。这些抗原决定簇基因片段以不同方式串联后与ｃｔｘＢ基因融合,构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量随所融合的抗原簇不同在１０－５０μｇ／ｍｌ之间,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯     

以霍乱毒素B亚基为佐剂的SARS病毒核酸疫苗的构建

由于冠状病毒主要通过粘膜系统侵人细胞,因此有效的粘膜免疫效应对于SARS的免疫预防具有重要作用。通过将SARS冠状病毒免疫保护相关的核衣壳蛋白和辐条蛋白与霍乱毒素B亚基基因融合,并克隆至真核基因表达载体,所构建的DNA候选疫苗在细胞内可表达霍乱毒素B亚基与SARS抗原的融合蛋白,从而可用于评价是否可有效产生粘膜免疫。     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

重组霍乱毒素B亚基与疟原虫多表位融合蛋白的免疫保护作用研究

对以霍乱毒素B亚基为载体蛋白的重组疟疾多价抗原在小鼠及恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用进行了研究。结果表明：该抗原免疫小鼠后,对约氏疟子孢子攻击的保护率在50%左右;恒河猴免疫后用1×10⁸食蟹疟裂殖子攻击,对照组2只动物在攻击后4d感染,感染持续30d以上;免疫组2只动物中,两只动物在感染6～7d后完全恢复,且1只推迟3d感染,说明该抗原具有免疫保护作用。