细胞工厂氧化还原状态的荧光探针检测与调控

氧化还原反应贯穿于细胞的整个生命历程,与细胞的新陈代谢息息相关。细胞的氧化还原平衡对细胞的能量代谢、生长代谢及合成代谢有着重要的影响。因此,细胞氧化还原状态的实时监测以及调控对于细胞工厂的高效生产有着重要意义。由于参与氧化还原反应的物质种类多、活性高、寿命短且相关代谢网络复杂,氧化还原状态的实时监测与调控一直是研究的热点与难点。本文中,笔者通过对影响细胞氧化还原反应的代谢物进行分析,以基因编码的荧光探针为主,介绍了检测细胞氧化还原状态的荧光探针,并阐述了调控氧化还原状态的常用方法及其在细胞工厂中的应用,为更好地实现细胞工厂的高效生物转化奠定基础。     

植物体内Ca2+,pH,ROS活体荧光探针成像研究进展

细胞内信号分子Ca2+与活性氧(ROS)以及细胞pH,是参与细胞多种生理和发育过程调节的关键因子。这些信号分子或细胞化学势之所以在如此众多方面起作用,是因为它们在生物体内从细胞到器官水平上、从数秒到数小时一直是在时空动态变化着的。恰到好处的是,荧光素感受器可以稳定地对细胞内Ca2+,pH与活性氧(ROS)活体原位实时定量。可视化的荧光细胞探针可分为两类:(a)直接染色;(b)基于绿色荧光蛋由基因编码的感受器。绿色荧光蛋白探针可在亚细胞水平上对目标蛋白准确定位,为得到细胞信号高分辨图提供可能。     

植物微流芯片——一种实时定量监测生长发育的高通量整合分析平台

生长发育是一个复杂的动态过程,了解其发生细节是生命科学研究的重要内容。最新发展起来的微流芯片技术为实现这个目标提供了新的途径。动物及微生物中的应用表明,该技术兼有实时定量监测和高通量整合处理的优势。在植物研究领域,用针对根生长特点和要求设计的根微流芯片结合荧光共振能量转移探针已经成功地检测出拟南芥(Arabidopsis thaliana)根细胞内葡萄糖和游离的Ca2+、Zn2+的浓度。随着各种底物特异的荧光共振能量转移探针的开发和应用,根微流芯片还可以用来检测植物细胞内激素或其它代谢中间产物的浓度及其动态变化过程。不仅如此,以微流芯片为基础发展起来的Plant Chip和Tip Chip则为研究植物与微生物的相互作用以及植物花粉管极性生长和细胞分裂分化提供了理想的平台。作为了解遗传因素或环境刺激导致细胞生命活动变化细节的有力工具,微流芯片技术有望为植物研究领域带来更多新的进展和突破。     

植物微流芯片——一种实时定量监测生长发育的 高通量整合分析平台

生长发育是一个复杂的动态过程, 了解其发生细节是生命科学研究的重要内容。最新发展起来的微流芯片技术为实现这个目标提供了新的途径。动物及微生物中的应用表明, 该技术兼有实时定量监测和高通量整合处理的优势。在植物研究领域, 用针对根生长特点和要求设计的根微流芯片结合荧光共振能量转移探针已经成功地检测出拟南芥(Arabidopsis thaliana)根细胞内葡萄糖和游离的Ca²⁺、Zn²⁺的浓度。随着各种底物特异的荧光共振能量转移探针的开发和应用, 根微流芯片还可以用来检测植物细胞内激素或其它代谢中间产物的浓度及其动态变化过程。不仅如此, 以微流芯片为基础发展起来的Plant Chip和Tip Chip则为研究植物与微生物的相互作用以及植物花粉管极性生长和细胞分裂分化提供了理想的平台。作为了解遗传因素或环境刺激导致细胞生命活动变化细节的有力工具, 微流芯片技术有望为植物研究领域带来更多新的进展和突破。     

apoaequorin-egfp融合基因对烟草的遗传转化及其分子检测

用钙离子报告基因非侵入式监测细胞内源钙离子实时变化是目前比较常用的钙离子监测方法。而基于传统荧光共振能量转移原理(FRET)的荧光探针具有较高的量子产率,则是目前应用于细胞或亚细胞水平钙离子检测的重要备选实验方案之一。然而,供体荧光基团的激发过程却经常给最终成像过程带来强的背景和荧光信号光漂白等干扰。水母发光蛋白(Aequorin)能够在底物存在的情况下和3个Ca~(2+)结合,通过氧化还原反应产生一个波长为469 nm的蓝光光量子,借助这一反应中蓝光光量子的产率与细胞中游离Ca~(2+)浓度间存在精确定量关系,研究者可以准确测量细胞内的钙离子浓度动态变化情况。但是由于蓝光的波长短,存在易于被散射而难于被检测等问题,造成了目前直接使用水母发光蛋白检测细胞内Ca~(2+)动态时,实验效率较低。为了解决上述这些问题,我们构建了一种将apoaequorin-egfp基因融合表达的植物双元表达载体,然后通过农杆菌介导的遗传转化法将这个融合基因整合到烟草的基因组中,建立了一个基于生物发光共振能量转移技术(BRET)技术,较为高效的植物细胞内源钙离子动态检测系统。     

利用双光子显微镜检测活体动物脑内 Ca2 +动态变化

利用正置双光子显微镜系统和荧光探针标记技术,观察脑内Ca2+分布,建立测量活体动物脑内Ca2+动态变化的实验方法。制作活体动物颅骨开窗样本,脑内负载Ca2+标记物Oregon Green 488 BAPTA-1和星型胶质细胞标记物Sulforhodamine 101,利用双光子显微镜分别检测神经元和星型胶质细胞内Ca2+分布和动作电位引起的Ca2+瞬变。结果显示双光子显微镜可探测到脑内250μm处荧光信号,图像清晰且信噪比高,并能实时检测神经元和星型胶质细胞内Ca2+信号的动态变化。活体脑内Ca2+检测技术平台的建立为基础研究和医药应用提供了在体实验依据。     

构建钙荧光探针细胞用于探究胞浆和线粒体钙对ATP刺激的响应

目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24 h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3～6 s)升至10倍,200 s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5～8 s),并且回落更慢,300 s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。     

活体动物体内光学成像技术的研究进展

生物发光和荧光成像作为近年来新兴的活体动物体内光学成像技术,以其操作简便及直观性成为研究小动物活体成像的一种理想方法,在生命科学研究中得以不断发展。利用这种成像技术,可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。利用光学标记的转基因动物模型可以研究疾病的发生发展过程,进行药物研究及筛选等。本文综述了现有活体动物体内光学成像技术的原理、应用领域及发展前景,比较了生物发光与几种荧光技术的不同特点和应用。     

利用荧光共振能量转移技术在活细胞内研究顺铂诱导的凋亡信号通路

为在活细胞内探讨顺铂诱导的凋亡通路．实验样品经顺铂处理后,应用基于荧光共振能量转移(FRET)原理设计的荧光探针pFRET-Bid和pSCAT-3来检测Bid切割和Capase-3活化的动态变化,同时,利用荧光成像在亚细胞水平对Bid转位线粒体的动力学特征进行了实时分析．结果表明：在顺铂诱导的细胞凋亡过程中,Bid切割发生在药物刺激后4～5 h, 历时(120±20) min．Bid切割活化后即从胞浆内转位到线粒体,历时(90±15) min．在凋亡后期,可以明显检测到Caspase-3 的激活．研究表明,应用FRET及荧光成像技术,可以在活细胞内实时、直观、可视地研究顺铂诱导的细胞凋亡过程,从而客观地反映了Bid、Caspase-3等蛋白质分子在该凋亡信号通路中的动态行为及时空传递特性．     

基于单分子量子相干调制的细胞温度成像技术

目的 细胞温度成像可以帮助科学家研究和理解细胞内部的温度分布,揭示细胞代谢和生物化学过程的关键信息。目前,基于荧光温度探针的细胞温度成像技术存在低温度分辨率和有限测量范围等限制。本文旨在利用单分子量子相干过程依赖温度的特性,开发一种单细胞温度成像和实时检测技术。方法 基于飞秒脉冲激光制备延时和相位可调的飞秒脉冲对,调制的脉冲对通过显微系统激发细胞内标记的荧光单分子,之后收集并记录每个荧光光子的到达时间。利用单分子相干过程与周围环境温度的关系,定义单分子量子相干可视度（V）,建立V与环境温度的对应关系。通过调制解调荧光光子的到达时间,获取单分子周围环境温度,结合扫描成像,实现细胞的温度成像和实时检测。结果 该方法可以实现高精度（温度分辨率<0.1℃）和大范围温度（10～50℃）的温度成像和测量,并观测到了单个细胞代谢相关的温度变化。结论 该研究有助于深入了解细胞代谢、蛋白质功能和疾病机制,为生物医学研究提供重要工具。     

活细胞RNA动态成像技术进展

RNA是生命“中心法则”的主要成员,广泛参与细胞内各种生命活动. RNA在活细胞内的区室定位和动态过程与RNA功能息息相关.因此,需要开发活细胞内RNA成像技术,追踪RNA时空动态过程,原位阐明RNA活性和功能,进一步解析RNA相关生命过程和疾病的关系.本文系统阐述两大活细胞RNA成像体系:(i)RNA发夹:荧光蛋白体系;(ii)荧光响应RNA适配体:小分子探针体系.并介绍其他可用于动态示踪RNA的技术,概述不同技术在追踪活细胞RNA方面的特点和问题,讨论RNA动态成像技术未来的发展方向.     

环化荧光蛋白生物探针荧光寿命成像研究进展

环化荧光蛋白探针作为一种新型的基因编码生物探针,是由荧光蛋白和对探测物有特异性响应的结合域蛋白构成的。由于其独特的构造方式使其在对探测物检测时具有较高的灵敏度和较大的动态范围,引起了越来越多科学家的兴趣,已发展成为监测生命活动的一种强有力工具。目前越来越多基于环化荧光蛋白技术开发的生物探针被广泛的应用于生物成像、药物筛选、细胞代谢物检测等领域,并发挥出了越来越大的作用。但是,这类探针目前仍然存在着开发工作量大,部分发光强度较弱及测量方法受限等问题,解决这些问题还需要科学家们不断的努力。对环化荧光蛋白生物探针进行综述,主要介绍了环化荧光蛋白生物探针的设计方法,已有探针的种类和基本性质,现阶段的发展状况以及存在的问题。另外,介绍了多种检测方法在环化荧光蛋白生物探针上面的使用,特别是近期出现的荧光寿命成像技术在其应用上的进展,比较了这些检测方法的优劣,旨在从多方面阐述环化荧光蛋白生物探针的发展现状,以便能给相关研究者提供一些参考和启发。     

重组腺相关病毒小鼠骨骼肌中近红外荧光蛋白表达及活体成像

近红外荧光蛋白因激发光和发射光波长位于近红外区,在动物组织中光吸收和光散射最低,更适宜于动物活体组织的深层成像.构建了一种携带近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein,iRFP)713基因的重组表达质粒pAAV-iRFP713,将重组表达质粒与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)rAAV-iRFP713.重组腺相关病毒表达载体感染体外培养的癌细胞,48h后,荧光显微镜检测显示近红外荧光蛋白在癌细胞中高效表达,荧光明亮.重组腺相关病毒表达载体注射小鼠骨骼肌,48h后,用近红外荧光活体成像系统检测证明近红外荧光蛋白在小鼠骨骼肌中表达较强, 活体组织成像清晰.实验结果表明近红外荧光蛋白在体内体外均能很好地表达并荧光成像,为动物活体组织标记和成像的研究提供新方法.     

量子点的荧光特性在生物标记成像中的应用及展望

与传统的荧光染料相比,量子点作为一种新型的无机荧光纳米材料,具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、光稳定性好、荧光寿命长、量子产率高和生物毒性小等优点,被广泛地应用于生命科学的许多领域,其在细胞标记(固定细胞和离体活细胞)和活体示踪成像领域具有独特的应用优势.它突破了传统的有机荧光染料在荧光性能及生物毒性等方面的不可克服的缺陷.它的应用,极大地推动了生命体系高灵敏、原位、实时、动态示踪成像研究的发展.该文综述了量子点的荧光性质及其在细胞标记(固定细胞和离体活细胞)和活体实时动态示踪成像中的应用,并对其在荧光原位杂交,流式细胞术,实时荧光定量pcr等方面的应用前景进行了展望.     

用于生物体内甲醛可视化检测的小分子荧光探针的研究进展

甲醛（FA）具有高反应活性和短的检测半衰期,广泛分布于生物体内和环境中。正常浓度范围的甲醛可以参与一碳循环,维持人体代谢稳态,而甲醛浓度的异常波动又会诱导机体病变,导致一系列疾病。实时测量甲醛在活细胞和组织中的浓度、持续时间和位置,对于破译甲醛的生理或病理功能、诊断和治疗甲醛诱发的疾病具有重要意义。有机小分子荧光探针具有灵敏度高、膜通透性好、实时原位分析、生物损伤小、操作方便等显著优势,是能够在时间和空间上实时监测细胞内甲醛浓度与分布的一种强大的非侵入性工具。近年来,一系列小分子荧光探针被开发出来用于生物体内甲醛的检测。本文将对这些用于生物体内甲醛可视化检测的荧光探针从识别机理（席夫碱反应、Aza-Cope重排）和荧光开启方式两方面进行阐述,并展望甲醛荧光探针的设计和研发方向。     

新型探针可高效监控细胞内生命活动

<正>香港大学化学系教授孙红哲领导的跨学科研究团队研发出了可在活体细胞内标记标签蛋白的最新荧光探针。相关研究成果日前刊登于美国《国家科学院院刊》,新技术已申请了美国及欧洲的专利。多年来,科学家致力于开发荧光标记技术用于监测细胞内的标签蛋白。孙红哲团队研发的新荧光探针能有效穿透细胞膜,为探测细胞内蛋白分子的活动情况提供简单、     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

NAD~+/NADH代谢机制研究进展

NAD+/NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶,小到细胞的各种生命活动,大到整个生命结构的平衡,都需要能量来维持。同时,细胞的氧化还原状态,特别是NAD+/NADH的水平直接影响着细胞的节律、衰老、癌变和死亡等重大生命过程。故而有关细胞内NAD+或NADH代谢的研究近年在国际上形成了一个新的热点。我们以NAD+/NADH代谢为重点,综述国内外关于该机制的研究现状。     

三套荧光显微成像系统在光敏剂亚细胞定位研究中的应用比较

目的：对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价。方法：分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网。采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究。结果：LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg／ml时的HMME的荧光图像,获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1/J2值)都明显高于细胞内J1/J2值。而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。结论：LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的结果相一致：孵育24h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核。ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。     

活体生物发光成像技术及其在病毒感染研究中的应用

生物发光是动物活体光学成像技术之一,因其反应灵敏、操作简单、数据精确,而被广泛地应用于生命科学研究多个领域,观测活体动物体内病毒复制、肿瘤生长等生命过程.生物发光技术采用荧光素酶基因标记细胞或病毒,与外源注射的底物荧光素发生反应,在冷CCD成像系统下显像并进行数据记录、分析.本文简要介绍活体生物发光成像这一新技术的原理...