基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立

目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

两种获取鱼类线粒体DNA的方法比较

直接从鱼类组织提取线粒体DNA和先提取基因组DNA再用相应引物PCR扩增所需mtDNA某一区域序列片段是获取鱼类mtDNA切实可行的两种方法。对这两种方法在使用过程中的注意事项、各自的优缺点及应用范围进行了较为细致的比较,为更好地利用mtDNA这一重要分子标记研究鱼类mtDNA的遗传多态提供参考。     

线粒体基因组测序策略和方法

本文综述了线粒体基因组测序策略和方法,在传统测序方法中介绍了基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法和基于PCR扩增产物的直接测序方法,后者重点介绍了基于长PCR扩增产物的引物步移法和基于总DNA的引物步移法;应用新一代高通量测序方法有基于总DNA样品的方法,包括需要预扩增mtDNA的多物种平行高通量和无需预扩增mtDNA的高通量方法,基于总RNA样品的转录组测序方法等。在实际工作中,选择哪种方法取决于研究规模、样品大小和保存状态、经费情况等。总的来说,基于长PCR扩增产物的引物步移法尤其适合小规模昆虫线粒体基因组研究,而对于大规模线粒体基因组研究来说,NGS技术无疑是省时省力的最佳选择。     

线粒体基因组的高通量测序策略

综述了高通量测序技术在线粒体全基因组测序中的策略,利用该技术对线粒体全基因组进行序列测定的方法可以归纳为两种,一种是先对目标mt DNA进行富集,包括mt DNA的提取纯化,目标区域PCR扩增法以及特异性探针杂交富集法(可分为基于微阵列和基于PCR探针的杂交富集法),然后对富集出的线粒体DNA进行高通量测序;另一种是先从待测样本的基因组高通量数据中挖掘出线粒体基因组序列信息,之后利用诱饵序列或者近缘物种的线粒体全基因组参考序列,使用软件MITObim对其进行组装。此外,还给出了线粒体高通量测序的优化流程图和介绍了混合样品的线粒体高通量测序策略。     

一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。     

线粒体DNA U4b单倍群:中国塔吉克族高原原发性高血压的遗传易感因素

目的:探讨线粒体DNA变异与中国塔吉克族高原原发性高血压的关系.方法:在中国塔吉克族人群中,收集了 53例高原原发性高血压病例和46例正常对照.通过PCR扩增线粒体DNA片段,经测序拼接获得线粒体全基因组,与剑桥序列比对以筛选线粒体DNA变异,分析在病例组与对照组中的分布差异,采用生物信息学工具预测阳性相关变异的功能....     

近交系小型猪线粒体基因组分析和家猪系统进化关系分析

广西巴马小型猪是长期近交培育而成的实验小型猪,遗传稳定.本研究拟通过线粒体基因组(mitochondrial DNA,mtDNA)分析来了解近交系的遗传背景,并从mtDNA角度进一步认识中国本土猪种的系统进化关系.实验设计29对特异性引物,PCR扩增和产物测序,拼接出广西巴马小型猪近交系7个世代猪的mtDNA序列;用4...     

新西兰白兔线粒体基因组全序列的测定与分析

本研究旨在获得新西兰白兔(New Zealand white rabbit)线粒体DNA基因组全序列(mtDNA).根据GenBank已经公布的近缘物种穴兔mtDNA全基因组序列(GenBank登录号:AJ001588.1),设计12对可覆盖新西兰白兔mtDNA全序列的引物,通过PCR扩增、测序、拼接,获得新西兰白兔线...     

适于蛹虫草遗传多样性研究的线粒体分子标记的筛选

摘要:【目的】从蛹虫草线粒体DNA中寻找适于遗传多样性研究的分子标记。【方法】通过PCR扩增和序列分析,比较了20个蛹虫草菌株在12个线粒体DNA片段和3个细胞核DNA片段上的序列变异。【结果】蛹虫草在线粒体DNA上的变异水平高于核DNA,主要表现为线粒体基因内含子的插入缺失多样性和较多的碱基变异位点。不同线粒体DNA片段的变异水平也有差异,而且内含子蛋白比外显子编码的蛋白质更易发生氨基酸的改变。增加使用的分子标记数目,其所揭示的遗传多样性程度也在逐渐提高。【结论】我们依 次推荐nad3-cox2、cox2-nad5、cox2、cox3、cob和cox1这6个线粒体DNA位点用于今后蛹虫草遗传多样性或群体遗传结构的分析。     

利用12S rRNA、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣干燥体

本研究旨在利用线粒体DNA上的12S rRNA基因、COI基因分子标记鉴定少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体。通过提取少棘巨蜈蚣干燥体样本DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S r RNA基因、COI基因片段,对PCR产物进行电泳检测及测序分析,测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,同源性分析,并用MEGA7.0软件对所有实验样品及少棘巨蜈蚣的近缘物种进行遗传距离分析、构建邻接(NJ)树以验证序列比对结果。结果表明,从少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch)干燥体中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA、COI基因片段。但所得蜈蚣样本12S rRNA基因片段序列与NCBI的GenBank中的物种的同源性无90%以上的。通过文献调研发现尚无蜈蚣12S rRNA基因片段的相关报道,将该序列作为新的基因序列注册到NCBI基因数据库中,该基因片段序列的GenBank登录号为JN558832.1。这说明利用线粒体DNA上的12S rRNA、COI基因DNA分子标记皆可准确鉴定动物种属。本研究得到的12S rRNA基因片段序列可作为后续准确鉴定少棘巨蜈蚣药材的分子标记参考。     

高通量测序数据的基因组拷贝数变异检测方法综述

拷贝数变异是指基因组中发生大片段的DNA序列的拷贝数增加或者减少。根据现有的研究可知,拷贝数变异是多种人类疾病的成因,与其发生与发展机制密切相关。高通量测序技术的出现为拷贝数变异检测提供了技术支持,在人类疾病研究、临床诊疗等领域,高通量测序技术已经成为主流的拷贝数变异检测技术。虽然不断有新的基于高通量测序技术的算法和软件被人们开发出来,但是准确率仍然不理想。本文全面地综述基于高通量测序数据的拷贝数变异检测方法,包括基于reads深度的方法、基于双末端映射的方法、基于拆分read的方法、基于从头拼接的方法以及基于上述4种方法的组合方法,深入探讨了每类不同方法的原理,代表性的软件工具以及每类方法适用的数据以及优缺点等,并展望未来的发展方向。     

DNA 12S rRNA基因序列测定在野生动物毛发样本鉴定中的应用

目的利用mtDNA 12S rRNA基因序列测定法对西藏自治区森林公安局送检的三件毛发物证进行种属鉴定,并探讨该方法在无毛囊毛发样本鉴定中的应用价值。方法用酚/氯仿法从毛发样本中提取出基因组总DNA,再用一通用引物通过PCR技术扩增mtDNA上12S rRNA基因的部分片段并进行序列测定。测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,再利用DNAMAN软件进行同源性分析。结果1号样和3号样扩增产物序列与藏原羚的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高达99%;2号样的序列与盘羊的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性高达98%。结论1号和3号样为藏原羚,2号样为盘羊。本研究所用方法在野生动物案件的样本鉴定中有极高的应用价值。     

一种结合单张芯片序列捕获和高通量测序技术测序外显子组的方法

随着高通量测序技术的发展,全外显子测序已经成为一种研究人类疾病的重要方法.本文展示了一种通过Nimblegen2.1M芯片进行外显子DNA序列捕获和高通量测序的方法,包括两步法文库制备.测序的平均覆盖深度达33倍时,95.6%的34M目标区域得到均衡覆盖,特异性达到80%.对比全基因组鸟枪法测序的结果,此方法在检测SNP时的假阳性率为0.97%,假阴性率为6.27%.本方法对于全基因组扩增的DNA也适用.结果显示,全外显子测序技术可以在大规模的群体研究和医学研究中起到重要作用.     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

目的获得东方田鼠的特异DNA序列.方法Aβ基因使用PCR,基因克隆,斑点杂交,DNA序列分析,生物信息学技术.结果根据小鼠MHCⅡ外显子2及其两侧序列,合成引物并扩增东方田鼠基因组DNA,将PCR产物回收、测序后,分别设计内引物扩增东方田鼠基因组DNA,其中一对引物可得到特异性扩增带,将得到的DNA片段插入PGEM-Teasy载体,进行序列分析.用这对引物扩增人、昆明小鼠、BALB/c小鼠及C57BL/6J小鼠基因组DNA,均无扩增产物.以东方田鼠特异性扩增产物为探针进行斑点杂交,除东方田鼠基因组DNA外,其他几种动物基因组DNA均为阴性结果.进一步对该DNA片段进行了BLAST同源性搜索和外显子预测,在Genbank中没有发现高度同源序列,并且找到一个可能的外显子,该外显子由69个氨基酸组成.结论获得的DNA片段为东方田鼠的特异片段,这将为从分子水平深入研究东方田鼠的遗传背景、生物进化规律以及东方田鼠抗日本血吸虫的机理奠定基础.     

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COIII基因(GenBank Accession No.DQ655706).对所克隆的序列分析表明.其序列包括鸭细胞色素C氧化酶III(COIII)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COIII基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COIII基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性.通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法.     

纵纹腹小鸮DNA指纹谱探针的筛选和初步应用

以人工合成的微卫星序列 (GTG) 5,(GT) 8,(CAC) 5和人源小卫星 33 1 5作引物 ,扩增纵纹腹小的基因组DNA ,产生多态性DNA片段 ,回收了 8个表现个体特异性的片段。当用小的基因组总DNA探针与它们杂交时 ,其中 2个表现阳性 ,说明PCR方法扩增出的高变异产物含有重复序列。用含重复序列的个体特异性PCR产物作探针 ,与无关个体小基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹 ,获得了变异性较高的DNA指纹图谱。且通过对京白鸡家系分析表明 ,用小基因组DNA的PCR产物分离制备的探针所获得的DNA指纹图带能够稳定的遗传。因此 ,高变异的PCR产物可以有效地用作DNA指纹探针。     

不同地域的冬虫夏草rDNA ITS区的序列分析和遗传分化

了解不同地区的冬虫夏草种内的遗传分化及变异情况,进行18S rDNA ITS区的序列分析,以期为它们的差别建立分子标记,也为不同地区来源的商品冬虫夏草的鉴定提供分子依据。冬虫夏草样品应用DNA提取试剂盒所提供的方法(CTAB法)提取基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度,DNA经PCR扩增,PCR扩增产物在DNA全自动测序仪上进行序列测定。测序结果获得6个不同地域的冬虫夏草18S rDNA ITS区基因序列图谱和GC含量(%)。实验结果表明,6个不同地区的冬虫夏草基因序列,反映了冬虫夏草种内的遗传分化和变异,其遗传分化与变异的程度与海拔高度和纬度呈正相关性,这些分化可应用于不同地区冬虫夏草的鉴定。     

动物种群遗传多态性研究中的PCR技术

基因组DNA的变异是种群遗传多态性研究的基础。PCR技术可以在反应管内经济快速地扩增特定DNA序列,在动物种群遗传多态性研究中的应用主要包括三个方面：(1)种群遗传多态位点的检测;(2)基因定位或利用已经定位的单拷贝基因设计染色体位点特异的分子标记;(3)与DNA测序技术相结合,高效经济地获取特定基因座位的全部遗传变异。     

纵纹腹小HaoDNA指纹谱探针的筛选和初步应用

以人工合成的微卫星序列（GTG）5,（GT）8,（CAC）5和人源小卫星33.15作引物,扩增纵纹腹小Hao的基因组DNA,产生多态性DNA片段,回收了8个表现个体特异性的片段,当用小Hao的基因组总DNA探针与它们杂交时,其中2个表现阳性,说明PCR方法扩增出的高变异产物含有重复序列,用含重复序列的个体特异性PCR产物作探针,与无关个体小Hao基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹,获得了变性性较高的DNA指纹图谱,且通过对京白鸡家系分析表明,用小Hao基因组DNA 的PCR产物分离制备的探针所获得的DNA指纹图带能够稳定的遗传,因此,高变异的PCR产物可以有效地用作DNA指纹探针。