Therapeutic applications of CRISPR/Cas9 system in gene therapy

Gene therapy is based on the principle of the genetic manipulation of DNA or RNA for treating and preventing human diseases. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nuclease9 (CRISPR/Cas9) system, derived from the acquired immune system in bacteria and archaea, has provided a new tool for accurate manipulation of genomic sequence to attain a therapeutic result. The advantage of CRISPR which made it an easy and flexible tool for diverse genome editing purposes is that a single protein (Cas9) complex with 2 short RNA sequences, function as a site-specific endonuclease. Recently, application of CRISPR/Cas9 system has become popular for therapeutic aims such as gene therapy. In this article, we review the fundamental mechanisms of CRISPR-Cas9 function and summarize preclinical CRISPR-mediated gene therapy reports on a wide variety of disorders.     

CRISPR/Cas9系统在疾病研究和治疗中的应用

基因组编辑技术(Genome editing technology)是一种通过人工手段在基因组水平对DNA序列进行改造的遗传操作技术,包括特定DNA片段的插入、敲除、替换和点突变.其中,依赖核酸酶的基因组编辑技术的基本原理是在基因组的特定位置产生双链DNA断裂(Double-stranded break,DSB)后通过...     

The CRISPR/Cas9 system: Their delivery,in vivo and ex vivo applications and clinical development by startups

The CRISPR/Cas9 gene editing system was originally derived from the prokaryotic adaptive immune system mediated by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR‐associated proteins (Cas). The system has been successfully applied to genome editing in eukaryotes and has contributed to remarkable advances in the life sciences, in areas ranging from agriculture to genetic disease therapies. For efficient editing and extending the influence of this system, proper delivery of its components is crucial. Both viral and nonviral delivery methods are reviewed here, along with the advantages and disadvantages of each. In addition, we review ex vivo and in vivo CRISPR/Cas9 applications for disease therapies. Related remarkable studies are highlighted and relevant startup companies and their drug development pipelines are described. © 2017 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 33:1035–1045, 2017     

纳米粒子在CRISPR/Cas9基因治疗中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为基因治疗领域最有前景的工具。在临床应用中,对CRISPR/Cas9进行安全有效的递送一直是亟待解决的问题。纳米粒子,如脂基纳米粒子、聚合物纳米粒子、纳米金颗粒以及生物膜类纳米粒子等,因其生物相容性、安全性和可设计性等特点有望为基因治疗带来新的突破。文中首先对纳米粒子的特性和基因治疗中CRISPR/Cas9的发展进行了概述,然后详细归纳了纳米粒子在递送不同形式的CRISPR/Cas9中的应用,最后对纳米粒子介导的基因治疗的递送在未来面临的挑战和安全性等方面作出总结论述。     

CRISPR/Cas9, a powerful tool to target human herpesviruses

Over 90% of the adult population is infected with one or multiple herpesviruses. These viruses are characterized by their ability to establish latency, where the host is unable to clear the invader from infected cells resulting in a lifelong infection. Herpesviruses cause a wide variety of (recurrent) diseases such as cold sores, shingles, congenital defects and several malignancies. Although the productive phase of a herpesvirus infection can often be efficiently limited by nucleoside analogs, these drugs are ineffective during a latent herpesvirus infection and are therefore unable to clear herpesviruses from the human host. Advances in genome engineering using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 facilitates virus research and may hold potential to treat or cure previously incurable herpesvirus infections by directly targeting these viruses within infected cells. Here, we review recent applications of the CRISPR/Cas9 system for herpesviral research and discuss the therapeutic potential of the system to treat, or even cure, productive and latent herpesviral infections.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的设计和分析

番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统II乙烯,易使番茄果实过熟,导致腐烂变质。SlACS2是番茄系统II乙烯合成的限速酶,通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统修饰该基因,调控系统II乙烯过量表达,将迟滞番茄过熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的数字表达谱,表明该基因呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。SlACS2位于番茄1号染色体,含4个外显子和3个内含子。利用在线工具CRISPRdirect 和CRISPR-P发现第1、2、3外显子分别具有18、9和11条sgRNA。其中,sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 种子序列在番茄基因组是唯一序列,GC含量高于40%,不存在TTTT终止序列。BLAST结果表明,sgRNA1-14和sgRNA3-8与GenBank公布的8条SlACS2同源序列高度一致,位于该基因的保守区,而与SlACS4和SlACS6的同源序列存在多个SNP,预示这2条sgRNA可用于番茄不同品种SlACS2基因的靶向编辑,并可规避对SlACS家族其他同源基因的脱靶效应。     

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用

CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统,用来抵抗外来病毒或质粒的入侵。近几年,由Ⅱ型CRISPR/Cas适应性免疫系统改造而来的CRISPR/ Cas9基因组编辑技术蓬勃发展,被广泛地应用于生命科学研究的各个领域,并取得了革命性的变化。文章主要综述了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的起源与发展及在生命科学各研究领域的应用,重点介绍了该系统在人类疾病基因治疗方面的最新应用及脱靶效应,以期为相关领域的科研人员提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展

基因组编辑技术的出现对植物遗传育种及作物性状的改良产生了深远意义。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是由成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白组成的免疫系统,其作用是原核生物(40%细菌和90%古细菌)用来抵抗外源遗传物质(噬菌体和病毒)的入侵。该技术实现了对基因组中多个靶基因同时进行编辑,与前两代基因编辑技术:锌指核酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酶(TALENs)相比更加简单、廉价、高效。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、番茄(tomato)等模式植物和多数大作物中实现了定点基因组编辑,其应用范围不断地向各类植物扩展。但与模式植物和一些大作物相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物,尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结,讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性,在此基础上提出了相关改进策略,并对CRISPR/Cas9系统在非模式植物中的研究前景进行了展望。     

Development of a CRISPR/Cas9 system for high efficiency multiplexed gene deletion in Rhodosporidium toruloides

The oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides is considered a promising candidate for production of chemicals and biofuels thanks to its ability to grow on lignocellulosic biomass, and its high production of lipids and carotenoids. However, efforts to engineer this organism are hindered by a lack of suitable genetic tools. Here we report the development of a CRISPR/Cas9 system for genome editing in R. toruloides based on a fusion 5S rRNA–tRNA promoter for guide RNA (gRNA) expression, capable of greater than 95% gene knockout for various genetic targets. Additionally, multiplexed double-gene knockout mutants were obtained using this method with an efficiency of 78%. This tool can be used to accelerate future metabolic engineering work in this yeast.     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

基于CRISPR/Cas9系统高通量筛选研究功能基因

利用功能缺失型(Loss-of-function)或者功能获得型(Gain-of-function) 策略高通量筛选功能基因,是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)的遗传筛选方法因操作简单、成本相对较低等优势,尽管已经得到了广泛的应用,然而其抑制效果不完全、脱靶效应明显等劣势依然存在。近年来兴起的CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/ CRISPR-associated protein 9)技术能快速、简便、准确地实现基因组敲除等编辑功能,因而成为一种强大的遗传筛选工具;在各种细胞系、人和小鼠及斑马鱼等多种模式动物中,大规模运用该方法筛选功能基因已经取得了巨大成功。本文总结了CRISPR/Cas9技术的特点,将其与传统基因工程方法进行了分析比较,回顾了近期相关的高通量功能基因筛选工作,最后探讨了该技术未来的发展趋势。     

CRISPR/Cas9技术在感染性疾病中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9),CRISPR/Cas9〕是一种新兴的基因编辑技术,与以前的三大基因编辑技术——归巢核酸内切酶、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶技术相比,其在靶向特异性、操作简便性、治疗彻底性、应用广泛性等方面具有更大的优势和发展潜力。艾滋病、乙型肝炎、疟疾等感染性疾病的治疗一直是医学上的重大难题,科学家正努力尝试利用CRISPR/Cas9技术解决这些医学难题。本文主要综述了CRISPR/Cas9技术在这些感染性疾病中应用的研究进展。     

CRISPR/Cas9技术在微生物研究中的应用进展

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)系统是在细菌和古生菌中发现的一种RNA指导的降解入侵病毒或质粒DNA的适应性免疫系统。由II型CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas9技术已经被开发成一种强大的基因组编辑和表达调控工具,并且广泛应用于基因功能研究、代谢工程和合成生物学等领域。本文从CRISPR/Cas9系统的发现过程、分类、作用原理、在微生物研究中的应用进展等方面进行总结,并展望了该技术的应用前景。