表征抗菌药物抑菌动力学的等效线药敏试验方法

以抗菌药物作用浓度与时间对抑菌率的协同作用,改进通行的药敏试验方法.采用Bioscreen全自动生长曲线分析仪,在线测定连续时间、连续固定浓度抗菌药物作用下禽致病性大肠杆菌BBZ6-3g在MHB中生长量(A600),建立了抑菌动力学检测体系.用Sigma plot构建以相对抑菌率RBR=1-At-i/At-0对抗菌药物浓度和作用时间的等效线图.等效线图全面地反映了药物浓度和时间对抑菌量的影响过程及趋势,兼具二维曲线的量化和三维曲面的直观特点,而且RBR通过归一化处理,消除了细菌群体的自然增殖的本底、不同接种量、不同抗菌药物的差异影响,可以直接比较不同抗菌药物的抑菌率,专门比较浓度和时间对抑菌率的影响.抑菌作用本质上是抗菌药物抑制细菌对营养物质的利用效率和程度,与细菌死亡是不同但是相关的过程.0.5 RBR为传统的目测最低抑菌浓度(MIC),以此为界,等效线图可以直观地分为3部分:分化区(0.5纵向等效线以左,全部浓度)、生长区(0.5以上的等效线)、抑菌区(0.5纵向等效线以右延伸且0.5以下的等效线).分化区边界时间在100~300 min,因此传统的药敏试验以8~12 h的终态来判断抑菌率,确定MIC是可靠的;抑菌区和生长区之间的等效线疏密,实际上是浓度依赖性和时间依赖性的依据.抑菌动力学检测体系和反映RBR的等效线图,改良了传统药敏试验方法,有望分析不同接种量对抑菌率和菌群变异的影响、不同浓度的抗菌药物后效应(PAE),比较不同菌种或不同抗药性水平菌株的抑菌动力学.     

以梯度平板法改进药敏试验方法及其药物浓度质量控制

药敏试验是临床选择敏感抗生素的精确检测工作,其成败在于质量控制的可靠性和最低抑菌浓度(MIC)的精确性、前瞻性.本文结合质控试验和药敏试验对梯度平板法进行验证,梯度平板法所测得的MIC与微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测得的MIC结果一致,且因为线性设置的药物浓度,MIC更加精确,能推算抗菌药物的原始浓度,更好地保证质控试验的可靠性.同时,按照美国临床实验室标准委员会或欧盟药敏试验委员会的敏感(S),中介(I)以及抗药(R)范围标准设置0-S,S-R,R-8R这样3个线性梯度,首先判断菌株敏感性范围,然后精确测定细菌群落的MIC值,并能有效分离出抗性菌株,预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,进而指导临床抗菌药物的选择和应用.梯度平板的主要困难在于手工制备的繁琐和不稳定性,如果自动化生产即用型梯度平板,将便利临床药敏试验,改进抗药性筛选技术.     

用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株

菌群在药物的最低抑菌浓度附近的动力学过程是抗生素药理学研究的核心问题.建立一种能确定精确的MIC且又能准确分离抗药性菌株的方法,是目前临床对药敏实验新的要求.根据Fick扩散定律制备了线性梯度平板：将15mL含适当浓度恩诺沙星的琼脂培养基在9cm培养皿中倾斜凝固,刚好覆盖整个平板底面,然后水平放置,再在其上层加入同样体积的无药琼脂培养基,凝固12h后,药物浓度达到扩散平衡而呈均匀连续线性梯度.通过实测验证药物浓度在平板表面呈线性梯度分布.将待检E.coli菌群均匀涂布在梯度平板上,培养12h后,随恩诺沙星浓度提高依次形成连续密集小菌落区和离散大菌落区,根据两区域的分界线可以确定菌群自然形成的真实的MIC,与常规药敏实验方法测定结果一致.大菌落重新涂布高梯度平板,分界线显著上升,并检测出抗药性基因突变,表明该方法很容易筛选出菌群中的抗药性菌株.梯度平板可以方便地呈现整个菌群在MIC附近的动力学过程和遗传生理变化,并预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,从而指导临床抗菌药物的选择和使用.     

急性肠道传染病实验手册(续一)——(腹泻病控制计划——CDD83.3)

<正>4、抗菌药物敏感性试验 下法常用于对抗菌药物的抗性试验。 稀释试验:为定量测定抗菌素活性,可把抗菌素稀释入肉汤或琼脂培养基中,然后接种试验菌株。过夜培养后能阻止活菌生长的抗菌素最小浓度,作为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。 扩散试验:在均匀混入试验菌株的琼脂培养基上放上抗菌素浸泡过的纸片或药片。在纸片周围生长的细菌受到抑制,抑制距离大小同该菌的敏感性相关,从而形成了抗菌药物的浓度梯度。     

构建大肠杆菌药敏试验新方法的探索

基于对大肠杆菌CVCC249菌株生长动力学过程的分析表明, 导致药敏试验结果不确定性的原因主要是由于不能测计“药物浓度与菌群数量的比值”及“药物浓度及其作用时间的复合作用”对菌群生长动力学过程的影响所致. 依据菌群在一系列不同浓度的庆大霉素及其作用时间下生长受到抑制的动力学过程分析和基于差分方法, 即用简单的差分计算代替复杂的微分方程的数值解法的应用, 提出了一个药敏试验的新方法: 用菌群浊度值的净增量以消除休止细胞存在的影响后, 以菌群浊度数列递推系数值的变化, 表征药物对菌群增殖的影响, 并结合用等值线图直观显示和分析药物浓度及其作用时间复合作用的方法. 抗菌药物的抑菌率可表征为药物浓度及其作用时间的复合函数的动态变化, 表明一类抗菌药物对某一菌株抑菌率的时间或浓度依赖性, 取决于其浓度和存在时间的复合效应. 用属于不同抑菌作用机理类型的恩诺沙星、左氧氟沙星和头孢曲松钠进行对比测试, 检验了这一新方法的有效性.     

芦荟对感染根管内厌氧菌抑菌作用的体外研究

目的:研究中药芦荟对根管内感染的5种厌氧菌的体外抑菌作用。方法:取感染根管内的常见优势菌:牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.e)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.a)、链球菌(Streptococcus)及中间普雷沃菌(Pseudomonas,P.i)的菌株,采用试管二倍稀释法,检测不同浓度芦荟制剂对上述菌株的抑菌效果。设空白对照组,阳性对照组为常规使用的根管治疗的封闭材料—氢氧化钙。采用纸片扩散法检测芦荟制剂的抑菌环大小。结果:不同浓度芦荟制剂均能明显抑制5种实验菌株生长,5种菌株的最小抑菌浓度(MIC)与最低杀菌浓度(MBC)不同,芦荟制剂对上述5种细菌在实验浓度范围内与氢氧化钙抑菌效果无显著差异;甲基红染色发现,不同MIC浓度的芦荟制剂使大肠杆菌变为淡红色,而使其他4种菌株均呈黄色;不同MIC浓度的芦荟制剂使5种菌株均产生抑菌环。结论:芦荟制剂抑菌效果较明显,可能作为根管内封药物的候选药物。     

头孢他啶联合阿米卡星对多重耐药的鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用分析

目的了解头孢他啶与阿米卡星联合对鲍曼不动杆菌体外药敏试验效果,探索多药耐药的临床用药新途径。方法采用微量肉汤稀释法、棋盘法分别测定头孢他啶、阿米卡星两药单独及两种不同浓度药物组合时对临床分离的24株多重耐药的鲍曼不动杆菌最低抑菌浓度(MIC),计算部分抑菌浓度(FIC)指数,应用FIC指数来计算及判读两种抗菌药物联用对多重耐药的鲍曼不动杆菌体外抗菌作用的效果。结果头孢他啶与阿米卡星联合应用,能显著降低各自的MIC值,分别有75%的菌株表现为协同作用,20.8%的菌株表现为相加作用,有4.2%发生无关作用,没有拮抗作用发生。结论对多重耐药的鲍曼不动杆菌的感染,可使用头孢他啶与阿米卡星进行联合治疗。     

牙周炎患者菌斑细菌的药敏分析

目的:了解牙周炎患者龈下菌斑细菌对于口腔常用抗菌药物的敏感性.方法:从慢性牙周炎患者龈下菌斑中分离培养牙周可疑致病菌,测定6种口腔常用抗菌药物对其的最低抑菌浓度,分析以上致病菌对这几类抗菌药物的敏感性.结果:共从50名慢性牙周炎患者牙周袋中分离培养72株革兰阴性厌氧菌进行药物敏感试验.全部实验菌株都对阿莫西林/克拉维酸敏感.对甲硝唑、替硝唑、奥硝唑未见耐药株产生.结论:对于慢性牙周炎患者龈下菌斑中分离的厌氧菌,阿莫西林/克拉维酸和硝基咪唑类药物甲硝唑、替硝唑和奥硝唑的抑菌作用强.     

抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响

通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.     

抗菌药物的降阶梯疗法

抗菌药物依照药效学特征可分为浓度依赖型和时间依赖型两大类。不同类型的抗菌药物应从药效学方面的不同来制定不同的给药方案。药效学是衡量药物浓度、药理作用及毒副作用的一门学科。目前,用于指导临床用药的药效学参数包括：（1）药物浓度高于最低抑菌浓度（MIC）的时间占给药间期的百分比（T〉MIC％）,受此参数制约的抗生素主要是β-内酰胺类和大环内酯类。（2）24h曲线下面积（AUC）与MIC的比率（24hAUIC）,其相关抗菌药物是氨基苷类及喹诺酮类等。（3）峰浓度（Peak）与MIC的比率,其相关抗菌药物有四环素、氨基苷类及喹诺酮类。     

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌体外抗菌活性分析

目的了解临床分离的59株碳青霉烯酶类抗生素耐药的肠杆菌科细菌(CRE)体外药敏情况。方法采用法国生物梅里埃公司VITEK-2Compact全自动细菌分析鉴定系统进行细菌鉴定及药敏,MALDI-TOF MS确认。琼脂稀释法测定临床常用抗生素的最低抑菌浓度。结果分离的菌株以肺炎克雷伯菌为主。59株CRE除对亚胺培南和美罗培南耐药率100.0%外,对哌拉西林/他巴唑坦和阿莫西林/克拉维酸同样完全耐药。头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南耐药率分别为91.5%、98.5%和94.8%。阿米卡星有较好的抗菌活性,耐药率为44.8%。替加环素耐药率最低,为22.0%。结论 CRE耐药率较高,头孢类、青霉素类及其复合制剂单独用药不适合作为本地区CRE菌株抗菌药物,需联合用药。替加环素目前可作为CRE理想用药,阿米卡星也可作为次选。     

蒜油对MRSA菌株的抗菌作用及作用机制研究

目的研究蒜油对MRSA菌株的抗菌作用及其作用机制,为治疗MRSA菌株感染提供实验依据。方法纸片法药敏试验测抑菌环直径,微量稀释法测其最低抑菌浓度(MIC),酶标仪测定不同时间MRSA菌株生长A640值,革兰染色镜检观察蒜油对MRSA菌株细胞壁的影响,SDS-PAGE凝胶电泳分析蒜油对MRSA菌株蛋白的影响。结果蒜油对MRSA菌株具有明显抗菌作用,其MIC和MBC分别为10mg/mL和20 mg/mL;1/2MIC和1MIC的蒜油作用MRSA菌株后,菌株生长曲线平缓,无对数期;且其对对数期细菌有明显杀菌作用;蒜油对MRSA菌株细胞壁无明显影响,凝胶电泳分析有特征条带出现。结论蒜油对MRSA菌株具有明显抗菌作用,其杀菌机制与蛋白合成有关。     

绿脓杆菌对鲎素耐受性特点及耐受性机制的研究

【目的】为了探讨鲎素作为抗菌药物在临床使用中的安全性问题,通过鲎素连续增高浓度法对绿脓杆菌进行耐受性诱导,并对其耐受性机制进行初步研究,以期为鲎素的广泛应用提供理论依据。【方法】绿脓杆菌ATCC27853为试验菌株,通过连续增高浓度诱导法筛选抗药菌株,并通过抗药稳定性、交叉抗药性、抗药性代偿测定来探究其耐受性特点,通过对其胞外蛋白酶活性、生物膜形成、胞外多糖含量的变化来探讨其抗药性机制。【结果】通过连续增高鲎素浓度法对原始菌株进行30多代诱导后,绿脓杆菌ATCC27853对鲎素的MIC值逐渐增高,80多代时产生了明显抗药性。抗药菌株对丁胺卡那以及pexiganan、鲎素同源肽tachyplesin III、polyphemusin I均能产生不同程度的抗药性。在无药培养基中抗药菌株以更长的延滞期作为抗药性代偿,但在有药培养基中具有更短的延滞期和更大的生长速率。抗药菌株较原始菌株分泌的胞外蛋白酶活性增高,并能降低鲎素的抗菌活性。在同样条件下抗药菌株较原始菌株胞外多糖含量增高,更易形成生物膜。【结论】在长期选择压力下绿脓杆菌ATCC27853对鲎素能产生抗药性,其抗药性机制可能与生物膜形成、胞外蛋白酶失活鲎素有关。关于细菌对鲎素的抗药性机制,有待进一步研究。     

大肠杆菌群体的生理异质性对药敏实验的影响

E. coli CVCC249分批培养的过程根据菌群瞬时生长速率的变化分为加速生长期、恒速生长期、减速生长期和衰亡期4个阶段. 各阶段分别取样, 测定抗生素浓度-杀菌曲线(concentration- killing curve, CKC), 结果表明菌群的生理异质性导致菌群个体间的药物敏感性不同, 总体呈现正态分布. 检测表明各阶段中菌群的核酸、蛋白质含量和脱氢酶活力都有明显差别, 这种生理异质性导致各阶段菌群对药物敏感性的差异. 以加速生长期菌群的CKC曲线为参照, 对于庆大霉 素, 恒速生长期和衰亡期菌群敏感性增强; 对于恩诺沙星恒速生长期反而减弱, 其他阶段差别不大. 这是常规药敏实验方法难以显示的, 表明对不同生理状态菌群的药敏实验测定结果可深入反映出药物的杀菌机理. 这有助于常规药敏实验方法的改进, 并可为抗菌药物的合理使用提供理论支持.     

贯叶连翘总提取物对致病细菌的抗菌作用

用平板抑菌法检测了贯叶连翘总提取物对细菌的抗菌谱范围,用最低抑菌浓度(MIC)检测法、最低杀菌浓度(MBC)检测法检测了其抗菌作用的强弱。结果表明提取物对供试革兰氏阳性菌菌株均有较强的抑菌和杀菌作用,对极少数革兰氏阴性菌菌株有较弱的抑菌作用,无杀菌作用。该结果提示提取物抗菌作用可能与细菌细胞壁的结构与组成相关。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素在大肠杆菌中的高效表达及其活性鉴定

【目的】菌株耐药性问题日益突出,研制新型安全高效的抗菌药物成为目前的研究热点之一。抗菌肽具有多种优良特性,高活性抗菌肽的开发及其重组表达对解决菌株耐药性问题具有重要意义。【方法】根据牛乳铁蛋白素与天蚕素的结构,设计一种新型的杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素(LfcinB-Cecropin),根据Escherichia coli密码子偏爱性合成其编码基因,利用同尾酶法构建含有不同LfcinB-Cecropin基因片段拷贝数的重组表达载体,转化到E.coli BL21(DE3)进行重组表达。【结果】经IPTG诱导,LfcinB-Cecropin融合蛋白成功获得表达。经超声破碎、包涵体纯化、甲酸裂解后,获得具有明显抑菌活性的杂合肽LfcinB-Cecropin。【结论】获得一种高活性的新型抗菌肽LfcinB-Cecropin,并实现了在E.coli中的高效重组表达。     

蒲公英不同部位提取物抑菌作用研究及口服液研制

为检验蒲公英的抗菌活性并制备出口感最佳的蒲公英口服液,试验采用药敏法和最低抑菌浓度值(minimum inhibitory concentration,MIC)检验蒲公英提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果,并以感官特性和黄酮含量为指标,并通过正交试验统计分析确定口服液的最佳工艺组方.结果表明:同浓度下全草水提物...     

粘菌素对耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌的抗菌作用

感染耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(CR-Ab)常与高发病率和死亡率相关联,而可供选择的治疗方案有限,大多基于与粘菌素联用。长期用药导致CR-Ab对粘菌素也产生一定抗性。为了评估含有或不含有粘菌素的不同抗菌组合对从CR-Ab感染患者收集的CR-Ab临床分离株的体外抗菌活性,本研究从本院就诊的患者中收集CR-Ab菌株,通过常量肉汤稀释法(MBD)测定最低抑菌浓度(MICs),通过定性(棋盘法)和定量(即杀菌测试)方法评估各组药物协同活性。结果发现所有菌株均是碳青霉烯类抗性的,且其中两株菌对粘菌素有抗性。棋盘法结果表明含粘菌素的组合在不同处理时间下具有完全协同作用,粘菌素+万古霉素和粘菌素+利福平表现出最高的协同增效作用;不含粘菌素的组合则在35.7%的菌株中观察到完全协同作用。杀菌测试表明粘菌素+美罗培南、粘菌素+替加环素和美罗培南+替加环素组合对粘菌素敏感和低粘菌素抗性的菌株具有杀菌和协同作用,而只有粘菌素+万古霉素和粘菌素+利福平组合表现出持久的杀菌活性。     

重症监护病房洋葱伯克霍尔德菌肺部感染及耐药性监测

目的 探讨重症监护病房(ICU)洋葱伯克霍尔德菌肺部感染的临床特点及其耐药情况,为临床合理用药提供参考.方法 对2010年10月至2011年10月在ICU住院期间,患者肺部感染洋葱伯克霍尔德菌耐药情况进行回顾性分析.结果 肺部感染患者共检出34株洋葱伯克霍尔德菌,占全部病原菌的1.85％.19种抗菌药物药敏试验结果显示除美罗培南、复方磺胺甲基异噁唑、米诺环素的抑菌活性较高外,其余16种抗菌药物的耐药率高达73.5％～100.0％.结论 洋葱伯克霍尔德菌具有多重耐药性,治疗难度大,应引起足够重视,临床应根据药敏试验结果合理选用抗菌药物.