用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株

菌群在药物的最低抑菌浓度附近的动力学过程是抗生素药理学研究的核心问题.建立一种能确定精确的MIC且又能准确分离抗药性菌株的方法,是目前临床对药敏实验新的要求.根据Fick扩散定律制备了线性梯度平板：将15mL含适当浓度恩诺沙星的琼脂培养基在9cm培养皿中倾斜凝固,刚好覆盖整个平板底面,然后水平放置,再在其上层加入同样体积的无药琼脂培养基,凝固12h后,药物浓度达到扩散平衡而呈均匀连续线性梯度.通过实测验证药物浓度在平板表面呈线性梯度分布.将待检E.coli菌群均匀涂布在梯度平板上,培养12h后,随恩诺沙星浓度提高依次形成连续密集小菌落区和离散大菌落区,根据两区域的分界线可以确定菌群自然形成的真实的MIC,与常规药敏实验方法测定结果一致.大菌落重新涂布高梯度平板,分界线显著上升,并检测出抗药性基因突变,表明该方法很容易筛选出菌群中的抗药性菌株.梯度平板可以方便地呈现整个菌群在MIC附近的动力学过程和遗传生理变化,并预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,从而指导临床抗菌药物的选择和使用.     

动态分析抗菌作用的新方法

最低抑菌浓度(MIC)是表征抗菌药物对细菌生长抑制最终效应的常规方法,不能描述抑菌作用的时间过程,药敏试验也不适用于高抗药性水平菌株的治疗方案确定.因此本文提出了一个普适性的新药敏试验方法.不同接种量的质控菌株Escherichia coli ATCC 25922和临床高抗药性水平菌株E.coli BBZ在不同系列浓度的6种抗菌药物(环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋、阿米卡星、硫酸黏菌素和多西环素)作用下,37℃下培养1200 min,连续检测时间序列点的光密度值A600作为反应变量,以相对抑菌效应(RIE=((a.b)/a)×100%)表征抑制效应,进而用等效线图表征药物浓度和时间协同抑制效应的动态过程,量化了浓度依赖型和时间依赖型,细化不同菌株对药物敏感性的差别.由此得到,达到最大抑制效应时,需要的最低药物浓度和时间,以及增大药物浓度或延长反应时间对抑制效应的影响,这正是临床用药最需要的信息.此外,大接种量下最大抑菌效应很低,表明不适合治疗.本方法为防治高抗药性菌株感染提供了药敏试验方法,也有益于促进新药研发药敏检测方法的改进.最后提出适于临床应用的、快速定性显示药物敏感性的方法的建议.     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

MicroScan AS-4微生物分析仪在室间质控中的应用

目的:通过质控菌株了解MicroScan AS-4微生物分析仪在细菌鉴定中的准确率及与药敏靶值的符合程度.方法:用AS-4微生物分析仪对质控菌株及药敏进行鉴定,并同时用K-B法进行药敏鉴定.结果:51株质控菌株准确率为88.2%(45/51),差异有显著性(x2=6.38,P＜0.05).用微生物分析仪和K-B法做药敏,结果与药敏靶值准确率分别为96.9%(x2=0.032,P＞0.05)、92.7%(x2=0.228,P＞0.05),差异无显著性.微生物分析仪与K-B法药敏差异元显著性(x2=0.062,P＞0.05).结论:只要严格按照操作规定进行操作,结果的符合程度还是比较高的,尤其是抗生素种类多,并能提示最低抑菌浓度、诱导酶、β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶,为临床准确选用抗生素提供了重要依据.但AS-4微生物分析仪、不能用于革兰用阳性杆菌的鉴定,真菌鉴定结果欠理想.药敏稀释浓度较少,与美国临床实验室标准化委员会规定的MIC断点低一个浓度,容易人为造成耐药率相对偏高.     

枯草芽孢杆菌抗药性突变株的筛选

从土样中分离出枯草杆菌,采用梯度平板法,利用链霉素,氯霉素,红霉素,四环素四种抗生素,对自然界中和经过紫外线诱变的菌株进行了抗药性突变株的筛选,我们发现分离出自然状态下的枯草杆菌没有抗药性,而经过紫外线诱变后,能够筛选出对链霉素具有抗药性的菌株.     

抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响

通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.     

纳米银的抗菌特性及对多重耐药菌株的抗菌作用

【目的】利用革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌的模式菌株分析纳米银的抗菌特性,并评价纳米银对多重耐药菌株的抗菌作用。【方法】利用生物法合成的纳米银,以微量肉汤法测定3种标准菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并计算MBC/MIC比值。用系列浓度的纳米银处理3株标准菌株后经平板计数法绘制时间-杀菌曲线。采用菌落平板计数法测定了纳米银对3种标准菌株的"抗生素后效应"(post-antibiotic effect,PAE),最后在生物安全II级实验室测定纳米银对临床分离的多重耐药菌株的抗菌作用。【结果】用生物法合成了粒径5–30 nm的纳米银,zeta电位为–19.5 m V。该纳米银制剂对3种标准菌株的时间-杀菌曲线均表现为时间依赖型抗菌作用。纳米银对大肠杆菌和白色念珠菌"抗生素后效应"随着浓度增加而增加,对金黄色葡萄球菌无明显"抗生素后效应"。纳米银对3种标准菌株的MIC值和MBC值均在1.00–4.00μg/m L之间;对3株人源性多重耐药菌MIC值在6.00–26.00μg/m L之间,MBC值在1.00–32.00μg/m L之间;对14株动物源性多重耐药菌MIC值在4.00–10.00μg/m L之间,MBC值在8.00–16.00μg/m L之间。纳米银对所有测试菌株的MBC/MIC值均小于2。【结论】纳米银是一种时间依赖型的抗菌剂,有不同程度的"抗生素后效应",对人源和动物源性多重耐药菌有杀菌作用。     

表征抗菌药物抑菌动力学的等效线药敏试验方法

以抗菌药物作用浓度与时间对抑菌率的协同作用,改进通行的药敏试验方法.采用Bioscreen全自动生长曲线分析仪,在线测定连续时间、连续固定浓度抗菌药物作用下禽致病性大肠杆菌BBZ6-3g在MHB中生长量(A600),建立了抑菌动力学检测体系.用Sigma plot构建以相对抑菌率RBR=1-At-i/At-0对抗菌药物浓度和作用时间的等效线图.等效线图全面地反映了药物浓度和时间对抑菌量的影响过程及趋势,兼具二维曲线的量化和三维曲面的直观特点,而且RBR通过归一化处理,消除了细菌群体的自然增殖的本底、不同接种量、不同抗菌药物的差异影响,可以直接比较不同抗菌药物的抑菌率,专门比较浓度和时间对抑菌率的影响.抑菌作用本质上是抗菌药物抑制细菌对营养物质的利用效率和程度,与细菌死亡是不同但是相关的过程.0.5 RBR为传统的目测最低抑菌浓度(MIC),以此为界,等效线图可以直观地分为3部分:分化区(0.5纵向等效线以左,全部浓度)、生长区(0.5以上的等效线)、抑菌区(0.5纵向等效线以右延伸且0.5以下的等效线).分化区边界时间在100~300 min,因此传统的药敏试验以8~12 h的终态来判断抑菌率,确定MIC是可靠的;抑菌区和生长区之间的等效线疏密,实际上是浓度依赖性和时间依赖性的依据.抑菌动力学检测体系和反映RBR的等效线图,改良了传统药敏试验方法,有望分析不同接种量对抑菌率和菌群变异的影响、不同浓度的抗菌药物后效应(PAE),比较不同菌种或不同抗药性水平菌株的抑菌动力学.     

头孢他啶联合阿米卡星对多重耐药的鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用分析

目的了解头孢他啶与阿米卡星联合对鲍曼不动杆菌体外药敏试验效果,探索多药耐药的临床用药新途径。方法采用微量肉汤稀释法、棋盘法分别测定头孢他啶、阿米卡星两药单独及两种不同浓度药物组合时对临床分离的24株多重耐药的鲍曼不动杆菌最低抑菌浓度(MIC),计算部分抑菌浓度(FIC)指数,应用FIC指数来计算及判读两种抗菌药物联用对多重耐药的鲍曼不动杆菌体外抗菌作用的效果。结果头孢他啶与阿米卡星联合应用,能显著降低各自的MIC值,分别有75%的菌株表现为协同作用,20.8%的菌株表现为相加作用,有4.2%发生无关作用,没有拮抗作用发生。结论对多重耐药的鲍曼不动杆菌的感染,可使用头孢他啶与阿米卡星进行联合治疗。     

126株淋病奈瑟菌耐药性分析及其所致感染的中西医结合治疗

目的研究近几年来淋病奈瑟菌(简称淋球菌)对抗生素的敏感性,探讨中西医结合治疗的有效性。方法对我科从2000年1月～2007年6月收治保存的126株淋球菌分别用纸片扩散法和快速药敏测试法进行15种药物的药敏检测,并用头孢曲松合并中药治疗。结果用快速定量药敏检测法测定的最小抑菌浓度(MIC)与用K-B法基本相符。对环丙沙星的耐药率为40%,1.50%的菌株耐大观霉素(MIC≥64μg/ml);所有菌株均对头孢曲松敏感。中西医结合治疗所有病例均获得痊愈。结论头孢曲松药物敏感性无明显变化,6年间未发现耐药菌株;环丙沙星耐药性显著上升。中西医结合在淋病治疗中有效可行。     

创伤弧菌抗菌药物药敏实验及结果分析

目的:本研究通过药敏实验对创伤弧菌进行抗菌药物敏感性分析,探讨在创伤弧菌感染中如何选择抗菌药物,提高临床治疗的效果.方法:利用ATCC标准的创伤弧菌菌株,进行了临床常用抗生素单个药敏实验和不同类型抗生素间的2种药物联合药敏实验.结果:创伤弧菌对抗革兰氏阴性菌的抗菌药物比较敏感,这些抗菌药物归属为(1)四环素类;(2)第三代头孢类;(3)第三、四代氟喹诺酮类;(4)新一代氧基糖甙类.四环素和头孢噻肟之间、氨苄西林和左旋氧氟沙星之间、复方新诺明和四环素之间等存在明显的协同关系,左旋氧氟沙星与头孢噻肟及四环素,头孢噻肟与庆大霉素及红霉素均不存在协同作用.结论:临床上主要应用抗菌药物对创伤弧菌感染进行对症治疗,本研究为临床中抗菌药物治疗创伤弧菌感染提供了实验依据,可作为临床用药和提高临床治疗效果的重要参考.     

急性肠道传染病实验手册(续一)——(腹泻病控制计划——CDD83.3)

<正>4、抗菌药物敏感性试验 下法常用于对抗菌药物的抗性试验。 稀释试验:为定量测定抗菌素活性,可把抗菌素稀释入肉汤或琼脂培养基中,然后接种试验菌株。过夜培养后能阻止活菌生长的抗菌素最小浓度,作为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。 扩散试验:在均匀混入试验菌株的琼脂培养基上放上抗菌素浸泡过的纸片或药片。在纸片周围生长的细菌受到抑制,抑制距离大小同该菌的敏感性相关,从而形成了抗菌药物的浓度梯度。     

CLSI M38-A2肉汤稀释法对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)的药敏检测

[目的]对保健食品生产菌株蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)进行6种常见抗真菌药物:伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、环吡酮胺、5-氟胞嘧啶、氟康唑的药敏检测.[方法]参考美国国家临床实验室标准化委员会CLSI M38-A2《肉汤稀释法抗真菌药敏试验参考方案》.[结果]质控菌株MIC值均在参考范围之内,蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)对以上6种药物的MIC值分别为1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L、≥128 mg/L、64 mg/L、2 mg/L.[结论]M38-A2方案适合用来测定蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)对抗真菌药物的敏感性,但获得菌株耐药敏感性的判别标准,仍需进一步的试验数据.     

肺炎克雷伯菌在儿科各病房的临床分布及耐药性分析

目的了解肺炎克雷伯菌在儿科普通病房、新生儿病房、小儿重症监护病房(PICU)的临床分布特点和耐药情况,为临床合理用药提供依据。方法对本院2011年1月1日至2015年12月31日儿科各病房采集到的标本进行分析,菌株鉴定采用法国生物梅里埃公司的VITEK 2COMPACT分析仪,药敏试验采用MIC法。结果本院儿科各病房共分离到487株肺炎克雷伯菌,主要来自痰液和鼻咽拭子;各病区中产ESBLs的肺炎克雷伯菌检出率在35.3%~42.7%之间。药敏结果显示,产ESBLs肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢菌素类、氨曲南100%耐药,对碳青霉烯类、氨基糖甙类、喹诺酮类抗菌药物敏感;未产ESBLs菌株耐药率相对较低。结论加强肺炎克雷伯菌的分离鉴定及耐药性的测定,是临床合理应用抗生素的重要依据。     

蒜油对MRSA菌株的抗菌作用及作用机制研究

目的研究蒜油对MRSA菌株的抗菌作用及其作用机制,为治疗MRSA菌株感染提供实验依据。方法纸片法药敏试验测抑菌环直径,微量稀释法测其最低抑菌浓度(MIC),酶标仪测定不同时间MRSA菌株生长A640值,革兰染色镜检观察蒜油对MRSA菌株细胞壁的影响,SDS-PAGE凝胶电泳分析蒜油对MRSA菌株蛋白的影响。结果蒜油对MRSA菌株具有明显抗菌作用,其MIC和MBC分别为10mg/mL和20 mg/mL;1/2MIC和1MIC的蒜油作用MRSA菌株后,菌株生长曲线平缓,无对数期;且其对对数期细菌有明显杀菌作用;蒜油对MRSA菌株细胞壁无明显影响,凝胶电泳分析有特征条带出现。结论蒜油对MRSA菌株具有明显抗菌作用,其杀菌机制与蛋白合成有关。     

Microscan AS-4和VITEK32微生物分析仪在室间质控中的应用

目的通过Microscan AS-4和VITEK32微生物鉴定／药敏分析仪对室问质控菌株的鉴定，了解2种仪器的差异性及与质控结果的符合程度。方法将质控菌株按操作规程进行操作，用Microscan AS-4和VITEK 32同时进行结果鉴定。结果Microscan AS-4和VITEK 32与36株质控菌株结果一次性的完全符合程度为72．2％(26／36)和80．6％(29／36)。结论VITEK 32对链球菌科的检出率与质控菌株结果的符合程度较高。Microscan AS-4对链球菌科的检出率相对较低。鉴定／药敏板中的苯唑西林最小稀释浓度为0．5μg／ml，按1999年版NCCLS药敏标准，苯唑西林对凝固酶阴性葡萄球菌MIC≤0．25μg／ml为敏感，MIC≥0．5μg／ml为耐药的标准不符合。     

铜绿假单胞菌ESBLs和AmpC酶的检测及耐药性分析

目的了解铜绿假单胞菌临床分离株ESBLs和AmpC酶的产生及对常用抗菌药物敏感性,指导临床合理选用抗生素。方法常规培养分离细菌,采用VITEK-60型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌;按NCCLS推荐的双纸片确证法和K-B纸片扩散法检测ESBLs和药敏试验;采用头孢西丁纸片扩散法筛选疑产AmpC酶阳性菌株,确诊采用三维试验。结果铜绿假单胞菌产ESBLs和AmpC酶总检出率分别为40.8%和38.2%,其中,单产AmpC酶、单产ESBLs和同产AmpC酶+ESBLs检出率分别为19.7%、26.3%和14.5%。药敏试验显示:产酶株的耐药性明显高于非产酶株,耐药现象在同产AmpC酶和ESBLs菌株中更为严重。结论台州地区临床分离的铜绿假单胞菌产ESBLs和AmpC酶菌株检出率较高。产AmpC酶和ESBLs的菌株呈高度耐药,临床上对产酶菌株引起感染的治疗应根据细菌药敏试验结果,合理选择有效的抗菌药物联合治疗,减少产酶菌株的产生和流行。     

大蓟提取物联合抗生素对分枝杆菌的协同抗菌作用

本文探索了大蓟提取物联合抗生素对分枝杆菌属模式菌株耻垢分枝杆菌的协同抗菌作用,以期从药用植物中鉴定新型抗分枝杆菌活性天然产物或新型抗菌增效剂。通过水煮法、索氏提取法、超声波法获取大蓟粗提物,采用管碟法、96微孔板二倍稀释法对三种粗提物进行体外分枝杆菌药敏试验,观察大蓟粗提物的抗分枝杆菌活性及与抗生素的协同抗菌活性。结果显示大蓟粗提物单独作用时,饱和浓度的大蓟水提物未表现出抗菌活性;索氏提取物和超声波提取物表现出一定的抗菌活性(MIC值均为8 mg/mL)。大蓟超声波提取物与抗生素联合作用时,与氯霉素、卡那霉素、庆大霉素和红霉素均表现出协同作用,其中与氯霉素、红霉素表现为明显协同。本文首次发现大蓟中存在与抗生素有协同作用的抗菌增效剂,为从药用植物中鉴定天然抗菌产物及抗菌增效剂奠定了一定基础。     

绿脓杆菌对鲎素耐受性特点及耐受性机制的研究

【目的】为了探讨鲎素作为抗菌药物在临床使用中的安全性问题,通过鲎素连续增高浓度法对绿脓杆菌进行耐受性诱导,并对其耐受性机制进行初步研究,以期为鲎素的广泛应用提供理论依据。【方法】绿脓杆菌ATCC27853为试验菌株,通过连续增高浓度诱导法筛选抗药菌株,并通过抗药稳定性、交叉抗药性、抗药性代偿测定来探究其耐受性特点,通过对其胞外蛋白酶活性、生物膜形成、胞外多糖含量的变化来探讨其抗药性机制。【结果】通过连续增高鲎素浓度法对原始菌株进行30多代诱导后,绿脓杆菌ATCC27853对鲎素的MIC值逐渐增高,80多代时产生了明显抗药性。抗药菌株对丁胺卡那以及pexiganan、鲎素同源肽tachyplesin III、polyphemusin I均能产生不同程度的抗药性。在无药培养基中抗药菌株以更长的延滞期作为抗药性代偿,但在有药培养基中具有更短的延滞期和更大的生长速率。抗药菌株较原始菌株分泌的胞外蛋白酶活性增高,并能降低鲎素的抗菌活性。在同样条件下抗药菌株较原始菌株胞外多糖含量增高,更易形成生物膜。【结论】在长期选择压力下绿脓杆菌ATCC27853对鲎素能产生抗药性,其抗药性机制可能与生物膜形成、胞外蛋白酶失活鲎素有关。关于细菌对鲎素的抗药性机制,有待进一步研究。     

长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌的耐药监测

目的了解长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）对常用抗菌药物的耐药现状,探讨金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药水平。方法收集长沙地区11家医院2009年11月至2010年11月临床分离的非重复金葡菌279株,应用Vitek-2全自动微生物分析系统进行鉴定,K-B法检测金葡菌对24种药物的敏感性,产色头孢菌素试验检测β-内酰胺酶以及D试验检测诱导型克林霉素耐药。应用头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法筛查耐甲氧西林的金葡菌（MRSA）,琼脂稀释法检测头孢西丁和苯唑西林的最低抑菌浓度（MIC）。结果在被检测的24种药物中,敏感率〉50%的药物为9种,未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药菌株;耐药率〉50%的抗菌药物有11种,其中以青霉素和氨苄西林的耐药率最高（均为97.1%）。MRSA的分离率达54.5%,且对常用的16种抗菌药物的耐药率均显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。279株金葡菌中,β-内酰胺酶阳性250株（89.6%）;红霉素耐药而克林霉素敏感或中介的30株中,D试验阳性22株（73.3%）。苯唑西林（OXA）和头孢西丁（FOX）MIC范围分别为0.125～〉256μg/mL和2～〉256μg/mL,苯唑西林的MIC50和MIC90分别为128μg/mL和256μg/mL,头孢西丁的MIC50和MIC90分别为64μg/mL和256μg/mL。结论长沙地区临床分离金葡菌对常用抗菌药物呈多重耐药;MRSA不仅分离率高,而且对甲氧西林呈高水平耐药。