基因枪法转基因水稻中hpt基因稳定遗传

基因枪转化将潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｐｔ）导入粳稻品种７７１７０,获得可育的转基因植株,研究外源基因遗传的稳定性。自交后代（Ｔ１和Ｔ２）经潮霉素筛选获得抗性植株和敏感植株,分子鉴定结果表明抗性植株带有ｈｐｔ基因,而敏感植株中没有ｈｐｔ基因存在。Ｔ１和Ｔ２代中潮霉素抗性表现为显性单基因位点的遗传方式,符合孟德尔分离规律,并得到分子鉴定结果的证实。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,ｈｐｔ基因多拷贝整合在水     

植酸在水稻(Oryza sativa L.)细胞培养中的促进作用

植酸(C_6H_(18)O_(24)P_6)添加到固体和液体培养基中,能显著降低多酚氧化酶活性,稳定培养基中pH值和mV值,并能促进水稻细胞生长,增强细胞抗褐化和水渍化能力,从而改善细胞状态。在培养基中植酸的最佳添加量为0.1%,配合使用MES可以增强其稳定pH值的效果。     

水稻遗传转化技术

就水稻遗传转化的方法、提高转化细胞再生频率的因素、转化过程中使用的选择标记、报告基因、启动子和目的基因以及未来水稻遗传转化研究的前景进行了概述和展望。     

hpt与bar基因作为水稻转基因筛选标记的比较研究

标记基因的选择是影响植物遗传转化和转基因后代筛选成败的关键因素。hpt与bar作为两种常用的水稻转化筛选标记被广泛应用于水稻的转化。为比较两者在实际应用中的效果, 文章首先对比了在潮霉素和除草剂(Bialaphos)两种筛选剂下水稻遗传转化的情况。研究表明, hpt基因的转化筛选体系相对于bar基因在转化效率上提高近两倍, 转化周期提前至少10 d, 且插入基因拷贝数更低。随后, 文章分析了利用潮霉素浸种法在田间筛选转基因水稻的可行性, 研究显示当潮霉素浓度大于167 mg/L时, 可以对以水稻品种kitaake为亲本的转基因材料进行有效筛选, 达到常规除草剂的筛选效果。但与除草剂相比较, 潮霉素的田间筛选成本却处于劣势。文章研究和讨论了hpt和bar基因在遗传转化和后代田间筛选中的优缺点, 并提供了一种利用潮霉素浸种法筛选转基因后代阳性植株的手段, 为将来在水稻转基因研究工作中根据实际需求选择合适的遗传转化、筛选体系提供参考。     

反向筛选标记基因upp在杀真菌链霉菌遗传改造中的应用

为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus ATCC 21013)进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对杀真菌链霉菌的无痕敲除系统。通过载体的整合、二次交换及反向筛选实现了杀真菌链霉菌基因组中StrR基因的快速无痕敲除。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除,因此值得进一步推广和应用。     

水稻(Oryza sativa L.)核基因组存在叶绿体psbA基因的同源片段

序列比较说明,重复DNA顺序pRRD9与水稻叶绿体基因组中编码QB蛋白的psbA基因存在高度的同源。用pRRD9亚克隆片段pRRD9R和片段pRRD9L对水稻的叶绿体和核DNA进行Southern杂交分析,揭示了psbA基因同源片段在某个进化时期由叶绿体基因组转移到水稻核基因组,而且两者在水稻进化过程中的变异程度存在明显的差异。利用它们对野生稻和栽培稻总DNA的Southern杂交分析,显示亚洲栽培稻与AA基因组型的野生稻有较近的亲缘关系,以及在部分野生稻产生特异的杂交带谱,说明它可以作为一种分子探针来研究水稻的进化问题。     

以木糖异构酶基因为筛选标记的玉米遗传转化

利用木糖异构酶基因作为筛选标记可以在含有不同浓度木糖的培养基上筛选出玉米再生植株,其中50％-100％木糖浓度的总体筛选效果较好,但不同玉米基因型之间筛选的最佳浓度差异很大。通过DNA点杂交、PCR及PCR．Southern印记法检测表明,木糖异构酶基因已经整合到转基因植株中。以木糖作为筛选剂,可以减小潜在的生物安全隐患。     

水稻(Oryza sativa L.)苗期低温白化突变体al12的超微结构与基因定位

水稻苗期低温白化突变是水稻在发育早期对低温胁迫的一种适应性,是一种受发育和温度控制的条件表达,它与其他水稻白化突变有本质的不同.本研究利用便携式叶绿素测量仪测定了白化时期植株的叶绿素含量和用透射电镜观察了叶绿体的结构变化.结果发现叶绿素平均含量仅为1.2(SPAD),而叶绿体也不能正常发育仅有囊泡状结构.通过与9311的正反交实验及子代的分离表现证明该性状受一个隐性核基因的控制.另外利用SSR分子标记技术将该基因定位在第8染色体上,两侧最近的SSR标记RM5068和RM3702分别距基因0.5～1.1 cM和4.9 cM,基因被定位在约6个cM的区间内.我们将该基因暂时命名为al12.     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究

本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) .     

两例水稻极端异常分离现象的遗传分析

遗传异常分离既是自然界非常普遍的现象, 也是生物进化的动力之一。产生异常分离的原因可能与配子体或孢子体的选择有关。利用6个以类病变(lmi)和矮杆突变体(d6)为亲本的杂交组合(F2或F3), 对该类病变和矮杆基因的遗传规律及异常分离现象作初步的分析。结果显示, lmi×02428和d6×93-11的F2群体以及F3株系中存在极端异常分离的现象; LMI基因附近的分子标记ST8-1和D6基因附近的ST7-1、ST7-2、RM5490的带型分离同样也极显著偏离期望比; 偏分离因子与类病斑LMI和矮杆基因D6紧密连锁, 分别位于第8染色体分子标记ST8和ST8-2之间以及第7染色体分子标记ST7-1和ST7-3之间。异常分离现象还与杂交的组合有直接的关系。     

根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立

比较了影响根癌农杆菌转化水稻的各种因素后,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。按该体系,水稻品种中花11号预培养4d的幼胚经农杆菌EHA105／pCAMBIA1301感染后,具有GUS基因瞬间表达的幼胚比例在50％以上,最高可达90％;按产生潮霉素抗性愈伤和转基因植株的比例计算,转化率分别达到87．6％和64．6％。转基因植株总DNA的Southern杂交分析表明T－DNA上的外源基因已整合进了水稻基因组,且在大多数转基因植株中表现为单拷贝插入;遗传分析证明T1代的表型分离符合孟德尔法则。此转化系统的建立为高效地将有用的外源DNA导入水稻植株奠定了基础。     

水稻耐贮藏基因（lox-3）DH作图群体构建方法的比较研究

以与水稻耐贮藏材料（Daw Dam）有丰富分子标记多态性的常规材料2070、明恢63、Dulur/协青早B为亲本,分别与之杂交,采用改良一步成苗花药培养法对其F1代进行花药培养,以一步成苗法为对照,评价新方法在构建耐贮藏基因DH作图群体中的应用潜力。研究结果表明,改良一步成苗法显著地提高了愈伤组织分化率、植株再生率、绿苗率、绿苗素质,而且得到的加倍单倍体系田间表现良好,是构建耐贮藏基因DH作图群体的理想方法,但在不同基因型间表现有一定的差异性,其中Daw Dam/2070、Daw Dam/明恢63组合的培养效率有较大增幅。利用改良一步成苗法已获得一定数量的DH群体,为开展进一步研究奠定了基础。 Abstract:Crosses were produced by using a storable rice variety (Daw Dam) and 2070,Ming Hui 63,as well as Dulur/Xie Qing Zao B as parents,among these materials there are abundant polymorphisms of DNA molecular markers.Their F1's were applied to generate DH lines by an improved method of direct induction of pollen plant.The method of the direct induction of pollen plant was used as check treatment to evaluate the improved method.The results showed that the improved method increased the re-differentiation percentage of pollen callus,the percentage of regeneration plantlets,and the percentage of green regeneration plantlets and produced more vigorous seedlings.The improved method was a competent method of establishing DH population for mapping lox-3 gene.It was also showed that the efficiency of the new method was different among genotypes and out of three experimental crosses Daw Dam/2070 and Daw Dam/Minghui 63 showed more efficient.More than 60 DH lines have been obtained in this experiment.     

Genetic analysis of plant regeneration in rice (Oryza sativa L.)

Summary A diallel study involving reciprocal crosses of four genotypes (IR8, 36, 54, and 64) was carried out to understand the genetic mechanism of plant regeneration from immature embryo-calli in rice. Regeneration frequency (% of calli that produced plants) varied from a high of 86% for IR54 to a low of 0% for IR36, while regenerated plants per embryo numbered from 0 to 7 when these same IR lines and the F₁ hybrids were compared. Combining ability analysis revealed that both nuclear (with both additive and dominant effects) and cytoplasmic genes are important in controlling regeneration in rice. Parental lines and F1 hybrids with high ability to regenerate were identified.     

由RTS-barnase嵌合基因的表达导致的雄性不育水稻植株

用PCR方法从水稻品种IR36的总DNA中扩增了RTS基因 5’调控区 (- 12 2 8～ 2 5 )顺序并与从解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)染色体DNA中克隆的RNase(barnase)基因编码区构建了嵌合基因 ,通过根癌农杆菌介导转化水稻品种ZH11,所获得转基因植株的主要性状与供体亲本无显著差异 ,但开花后药壁不开裂 ,并且大多数植株的花粉不被I KI染色 ;自交条件下结实率为零 ,表现为完全不育 ;而用空载体转化所得到的植株及未转化的对照植株则是可育的。转基因不育株经人工授以正常的花粉 ,可以获得杂交种子。F1代的遗传分析结果表明 ,以单拷贝整合于不育植株基因组中的RTS barnase嵌合基因可以通过杂交遗传并且雄性不育性状与其存在直接相关     

杂草稻红色果皮基因的遗传分析

以江苏扬中红色果皮杂草稻W16、粳型广亲和品种02428(S5n)及以它们为亲本的衍生世代F1、F2和F3为材料,研究了杂草稻红色果皮性状的遗传特征;根据已克隆的普通野生稻(O.rufipogen)红色果皮Rc与白色果皮rc等位基因第6外显子的差异,设计了InDel标记RID14,利用RID14标记对F2群体、江淮流域所收集到的24份红色果皮杂草稻、3份普通野生稻以及423份品种资源进行了标记基因型分析;选取5份江淮流域杂草稻的RID14标记PCR产物进行测序分析.结果显示:以白色果皮02428为母本的杂交种F1的颜色为白色,而以红色果皮杂草稻W16为母本,杂交种F1的果皮颜色为红色;正反交杂种F1所结F2种子都是红色,F2植株所结F3种子果皮颜色发生分离,符合3∶1分离比例;在F2群体中,RID14标记与果皮颜色共分离,在450份材料中,红色果皮均为非缺失带型,而白色果皮和紫色果皮为缺失带型;5份江淮流域杂草稻的RID14标记PCR产物序列与已登录的普通野生稻序列完全一致.研究表明,扬中杂草稻红色果皮为单基因控制的显性性状,并由母体基因型决定,是典型的延迟遗传,由Rc基因控制;在白色果皮材料资源中都存在14 bp缺失的等位基因rc,RID14标记可以作为准确鉴定红色果皮杂草稻的分子标记.     

Genetic studies of rice (Oryza sativa L.) anther culture response

Anthers of two rice (Oryza sativa L.) varieties, Lunhui 422 (P₁) and Jinzao 5 (P₂), their F₁, F₂ and first backcross generation-F₁ x Lunhui 422 (B₁), and F₁ x Jinzao 5 (B₂)-were cultured in L8 medium to study the inheritance of rice anther culturability using generation mean analysis. Significant effects of generation were observed for the four traits measured: anther response (%), frequency of callus induction (%), frequency of callus differentiation (%) and culture efficiency (%). Variation among the generations was similar for all traits: significant differences were found among six generations and the means of the P₂ and B₂ were significantly lower than those of the other generations. The frequency of callus differentiation showed a nonsignificant difference among the P₁, F₁, F₂ and B₁ generations which had slightly high values than the P₂ and B₂. Additive genetic variance (V_A) was higher than non-additive genetic variance (V_D) for anther response and frequency of callus induction. However, A_V was lower than V_D for frequence of callus differentiation and culture efficiency, V_A was significant for all traits except for the culture efficiency, and V_D was nonsignificant for all traits except for the frequency of callus differentiation. On the other hand, environmental variation (V_E) was significant for the 4 traits. Narrow-sense heritability estimates were 95.52%, 82.19% and 13.54% for anther response, frequency of callus induction and culture efficiency, respectively.Abbreviations 2,4-d 2,4-dichlorophenoxyacetic acid - IAA indole-3-acetic acid     

Gene flow from transgenic rice to red rice (Oryza sativa L.) in the field

In this study, we simulate a transgenic rice crop highly infested with red rice to examine transgene transfer from a transgenic line (A2504) resistant to glufosinate ammonium to cohabitant red rice. The red rice was sown along with the transgenic line at the highest density found in naturally infested crops in the region. Agricultural practices similar to those used to control red rice infestation in northern Italy rice fields were used to reproduce the local rice production system. During the first 2 years, the field was treated with herbicide at the appropriate time; in the first year the dosage of herbicide was three times the recommended amount. In this first year, detectable red rice plants that escaped herbicide treatment were manually removed. Nevertheless, two herbicide‐resistant hybrid plants (named 101 and 104) were identified in the experimental field during the second year of cultivation. Phenotypic and molecular characterisation suggests the hybrid nature of these two plants, deriving from crossing events involving A2504, respectively, with red rice (plant 101) and the buffer cultivar Gladio (plant 104). The progeny of two subsequent generations of the two plants were examined and the presence of the transgene detected, indicating stable transfer of the transgene across generations. In conclusion, despite control methods, red rice progeny tolerant to the herbicide can be expected following use of transgenic rice and, consequently, difficulties in controlling this weed with chemicals will emerge in a relatively short time.     

柱花草nptII、hpt和bar基因优化转化体系的建立

以热研5号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.Ryan No.5)为材料,系统地研究了不同选择标记基因NptII,hpt和bar的柱花草转化体系.研究发现柱花草最适合基因转化的外植体是幼苗下胚轴.最佳愈伤组织形成和愈伤组织分化培养基为M S+NAA 1.0m g/L+6B-A4.0m gL/+3%蔗糖,pH6.最适宜外植体生根培养基是MS+N AA0mg/L+3%蔗糖(pH6).Glufosinate选择压力为0.15m g/L,Kanam ycin选择压力为20mg/L,Hygrom ycin选择压力为15m g/L.在以上的优化转化系统中,柱花草幼苗下胚轴分别侵染带NptII,hpt和bar基因的农杆菌(GV 3101)后,可获得30%愈伤组织具有kanamycin抗性,5%愈伤组织具有Hygromycin抗性,50%的愈伤组织具有Glufosinate抗性.     

不同环境条件下稻米透明度的发育遗传分析

采用条件和非条件数量遗传分析方法,研究了不同环境条件下灿稻稻米透明度的发育遗传规律。稻米4个发育时期两年数据的分析结果表明,开花受精后第8～21天的灌浆中期和后期遗传效应表达对稻米透明度的影响最大。控制稻米透明度性状表现的三倍体胚乳核基因、细胞质基因和二倍体母体植株核基因效应在不同环境下存在着表达水平上的差异。条件遗传分析的结果还表明一些遗传效应存在着发育时期间断表达的现象。基因加性效应和细胞质效应以及相应的环境互作效应在稻米透明度性状发育中起着主要作用,选择可以取得良好的改良效果。浙南3号和1391等亲本可以提高后代的稻米透明度。